Team:Chiba/Experiments:copy number

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Revision as of 20:16, 29 October 2008

Copy number of Receiver Plasmid

Design

レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた

Experiment

oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

Sender

Receivers

**BBa_S03623 (AHL autoinucer)

- BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL) |

Low Copy Receiver

これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(BD⊿FliC).
Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
Washed sender and receivers.
Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
Incubated at 30°C.
Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)

Result & Discussion

(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。

この理由は

GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。したがって理由1が有力である。（小林）

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 以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。
-===='''Sender'''====
+{| class="tbl" |
-*AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
+|-
-[[Image:LuxI-sender Chiba.gif|left|]]<br clear=all>
+|
+*'''Sender'''
-===='''Receiver'''====
+|
-*[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]
+*'''Receivers'''
-[[Image:High-Copy-Receiver Chiba.gif]]<br clear=all>
+|-
+| rowspan="2" | **[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]
+[[Image:LuxI-sender Chiba.gif]]
+|
+**[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] |
+[[Image:High-Copy-Receiver Chiba.gif]]
+|-
+|
 *Low Copy Receiver
 [[Image:Low-Copy-Receiver Chiba.gif]]
+|}
+<br clear=all>
 これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。