Team:Chiba/Project/Experiments:Receiver Crosstalk

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(Difference between revisions)

Revision as of 21:30, 29 October 2008

Receiver Cross-talk

Design

Fig.　 Crosstalk

Table. LuxR family gene Data modified from M.RIVAS et.al. Biol Res 38: 283-297, (2005)

Fig. Comparison of the predicted Lux box. Data modified from A.Fekete et.al. Anal Bioanal Chem 387:455–467,(2007)

クオラムセンシングにおける、レシーバータンパクを変えてクロストークを起こさせる。
センダーを変えたときと同様に、他種生物由来のレシーバーでもAHLに応答することは知られている⁽¹⁾⁽²⁾。
本来の組み合わせとは異なるAHLを受け取るレシーバーの応答時間は遅くなり、遺伝子発現が遅くなる。
異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質はTableに示すとおりである。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっている。

また、LuxR protein familyはLux boxという特定の配列を持ったプロモーター下にある遺伝子の発現を活性化する。(Fig. ) Lux boxも生物種によって配列が異なるが、ほとんど変わらない配列を持っているために違った生物種のLuxR protein familyであっても、AHLが存在下で遺伝子発現を活性化すると考えられる。

Experiment

LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

Sender
- AHL autoinucer(BBa_S03623)

Transcriptional regulator

LuxR

RhlR(BBa_K084004)

LasR(BBa_K084005)

CinR(BBa_K084006)

Reporter

Plux-GFP(BBa_J37032)

Method

more about Receiver phase crosstalk

Result & Discussion

Fig.Time Delay Test LuxI-LuxR

Fig.Time Delay Test LuxI-LasR

Fig.Time Delay Test LuxI-RhlR

more about experimental result

Demo ~Receivers~

English:
日本語:
固体培地中にセンダーBBa_S03623,(Ptet-LuxI) を混ぜ、固体培地表面にレシーバーのコロニーをN.Cフィルターで移す。センダーの作るAHLは培地中を移動し、表面のレシーバーがAHLを一定濃度感知すればGFPを発現する。一種のセンダーに対し、様々な種類のレシーバーを用いることで時間差が生じることを確認する。

用いるレシーバーは・・・

・シグナル自体を分解するAiia を利用する

・レシーバーの遺伝子回路を含むプラスミドのコピーナンバーの変化

・レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れる　　　　　

・確認の仕方
N.Cフィルターをはった個体培地を37°Cで培養し、時間(30min?)ごとにUVをあててGFPが見えるかチェックする。
香取

Results

--->more about Demo experiments detail

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+===Experiment===
+LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。
+AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。
+AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。
+AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。
+蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。
+使った遺伝子回路は以下の通りある。
+*'''Sender'''
+**AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
+[[Image:LuxI-sender Chiba.gif|left|]]<br clear=all>
+*'''Transcriptional regulator'''
+:*LuxR
+[[Image:LuxR-p15A Chiba.gif]]
+:*RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]
+[[Image:RhlR-p15A Chiba.gif]]
+:*LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]
+[[Image:LasR-p15A Chiba.gif]]
+:*CinR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084006 (BBa_K084006)]
+[[Image:CinR-p15A Chiba.gif]]
+*'''Reporter'''
+:*Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]
+[[Image:Plux-GFP-pMB1 Chiba.gif]]
+===Method===