Team:Chiba/Project/j

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Contents

プロジェクトオーバービュー

（１）私たちは、複数のシグナル機構を用いることで、遺伝子発現のタイミングを調節する。

（２）この調節機構にはquorum sensingという細胞間コミュニケーションの原理を利用する。

（３）私たちのプロジェクトでは、Senderが伝達物質（AHL）をつくり、ReceiverはAHLがある一定濃度に達した時、活性化される。

（４）これらの送受信装置は由来する生物ごとに特有のセットをなしているが、異種の送受信装置同士もCross-talkすることがわかっている。

（５）ただし、Cross-talkによるコミュニケーションは感度が鈍いため、Receiverの活性化が遅くなる。

プロジェクトデザイン

  • クオラムセンシング

特定の入力に曝されたバクテリアは、シグナル分子（AHL:N-Acyl-L-homoserine Lactone）を合成する。シグナル分子が閾値を超えると、レポータータンパク質が発現。入力にさらされていた時間を知らせる、タイマーとなる。

感度差による応答時間の差

任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。

Controlling the Delay time of the AHL signaling

LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。

  1. LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる
    LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。C. H. Collins.et al.Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723
  2. クロストークを使う（その１）
    AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/100である.M.K Winson et al.:FEMS Microbiology Letters(1998)
    AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
  3. クロストーク（その２）-LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合-
    LuxRの変異体を作成すれば、3OC6HSL以外のAHLs(C10HSL, C6HSL, C8HSL, C12HSL,3OC12HSL)でもactiveとなる。C. H. Collins. et al.Nature Biotechnology.24, 708 - 712 (2006)
    Fig.2(wild-type LuxR,LuxR-G2E,LuxR-G2E-R67MのAHLs感受性を評価したグラフ)参照。LuxR変異体(LuxR-G2E,LuxR-G2E-R67M)を作成しており、これらは3OC6HSL, C10HSL, C6HSL, C8HSL, C12HSL,3OC12HSLによってactiveとなる。

クオラムセンシングのクロストーク

生物によってAHL(Acyl-L-Homoserine Lactone)のアシル基が異なる(ref.3).
生物ごとのクオラムセンシングについては、ref.9参照.


Strain Signal Molecule Enzyme
P.aeruginosa C4-HSL RhlI
V. fisheri C6-3-oxo-HSL LuxI
A.tumefaciens C8-3-oxo-HSL TraI
P.aeruginosa C10-3-oxo-HSL VanI
P.aeruginosa C12-3-oxo-HSL LasI
R.leguminosarum C14-3-hydroxy-HSL CinI

Construction(From BioBrick)

  • Sender(Autoinducer synthase)
LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
  • Receiver
LuxR,LasR,CinR,RhlR
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