Team:Chiba/Reporter

From 2008.igem.org

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*LacZはX-galの濃度によって目視での確認時間が変わった
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:X-galの濃度を変えて計測
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*液体、固体似たような結果になった(目視での確認時間)
[[Image:LacZ chiba.gif]]
[[Image:LacZ chiba.gif]]
[[Image:Reporter chiba.gif]]
[[Image:Reporter chiba.gif]]

Revision as of 14:07, 29 October 2008

Chiba-U.gif

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Reporter

レスポンスの早いレポーターを選ぶことが目的


  • Luciferase
  • 蛍光たんぱく
  • β-gal (X-gal assay)

Experiment

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

大腸菌:XL10G

  • 蛍光たんぱく
  • GFP
  • pGFPuv
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
Reporter 9002 chiba.gif
  • Venus YFP
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K084003 BBa_K084003]
K084003 chiba.gif
  • pLac-Venus YFP-
PLac Venus Chiba.gif
  • mCherry
  • pLac-mCherry
  • β-gal (X-gal assay)
  • PUC19(plac-LacZ)
  • 装置 Equipment
shaking incubator(37°C,30°C)
Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
46-well plate(deep well)
96-well plate(deep well)
Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)


  • 固体編

固体培地(pLacであれば0.2%グルコース入り)にまく
コロニーを新しい固体培地(pLacであればIPTG, ptetであればAHL, LacZならばIPTGとX-gal)にコロニーリフトする=スタート
37°Cのしんとう培養器で培養
30分ごとに目視で確認できるか観察

  • 液体編

プレ培
コロニーを固体培地からピックし、LB培養液2ml(pLacであれば0.2%グルコース入り)で12時間培養(37°C)
本培
OD値を計測して、菌数を合わせるため培養液を1/200に希釈する。
OD=1.00くらいになるまで37°Cで培養
生理食塩水で洗浄(2.0min 8,000rpm)x2
46穴または96穴deep wellにM9(2ml)で培養
IPTG(最終濃度0.1mM),AHL(最終濃度100nM)を加えて、計測開始
30分ごとに蛍光強度、OD値を計測、また目視で確認できるか観察

Result

  • LacZはX-galの濃度によって目視での確認時間が変わった
X-galの濃度を変えて計測
  • 液体、固体似たような結果になった(目視での確認時間)

LacZ chiba.gif Reporter chiba.gif

Conclusion

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

分解されやすいLuciferineやX-galを基質とするLuciferaseやβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまう

そのため、基質のいらない蛍光タンパク質が適している。

基質も合成するLuxCDABEを発現させると、レスポンスが早くなる可能性がある。

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