Team:Chiba/jk/γ/Trl

From 2008.igem.org

Revision as of 01:46, 30 October 2008

実験ログ
出力班

Time Responce Liquid

purpose

インダクションをかけてからいち早く、確認できる出力を見つけること
To find the earliest output gene after induction

Equipment

shaking incubator

Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)

46-well plate(deep well)

96-well plate(deep well)

Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)

Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)

Method

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

Strain:XL10G Kan^R

• Liquid medium experiment

1. Pre-culture
   1. Picked and cultured the following plate in 2mL of LB:
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, (BBa_T9002, BBa_K084003)
   2. Cultured at 37°C for 12h.
2. Culture
   1. Dilute pre-cultures and add to new LB medium.
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, (BBa_T9002, BBa_K084003)
   2. Cultured at 37°C for about 6 h
3. Wash
   1. Transfer 10mL each of the culture to 50mL centrifuge tubes.
   2. Centrifuged for 6min at 3600rpm,20°C and discarded the supernatant.
   3. Add physiological saline and resuspention
   4. Repeated wash twice.
   5. Add M9 minimal medium.
4. Mix
   1. Dispens each culture into 48-well deep well or 96-well deep well
   2. Add IPTG fainal conc. 0.2 mM (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
   3. Add AHL fainal conc. 100nM (BBa_T9002, BBa_K084003)
5. Measure fluorescence intensity every 1 h.

Result

• 28,August,2008
• 5,September,2008
• 10,September,2008
• 14,September,2008

Discussion

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

• X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
• X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる

以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している

またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった

• 目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった

以上の理由から、出力はGFPとする。

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