Team:Chiba/notebook/input/august
From 2008.igem.org
(→2008.8.21) |
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<BR>37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。 | <BR>37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。 | ||
<BR>UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ10<sup>5</sup>希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。 | <BR>UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ10<sup>5</sup>希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。 | ||
+ | |||
<BR>37℃で12h培養した後のコロニー数 | <BR>37℃で12h培養した後のコロニー数 | ||
+ | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
+ | <td width="257"></td> | ||
+ | <td>AHLなし</td><td>AHL100nM</td> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>15min</td> | ||
+ | <td>136</td><td>0?</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>4h</td> | ||
+ | <td>40</td><td>31</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>8h</td> | ||
+ | <td>10</td><td>0</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>12h</td> | ||
+ | <td>0</td><td>0</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | </table> | ||
+ | <BR> | ||
+ | いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。 | ||
== 2008.8.25 == | == 2008.8.25 == |
Revision as of 06:23, 30 September 2008
8月の実験ログ
Contents |
2008.8.20
PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤
Sample No | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
DNA tamplate | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
FW primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
VR primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
dNTPmix | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
thermo pol buffer | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
DNA pol(VENT) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
dH2O | 68 | 68 | 68 | 68 | 68 |
TOTAL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
→gel check:Gel Check
Sample No | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
Sample DNA | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
loading dye | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
dH2O | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Total | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
→どれもバンド出ず。
trnsformation:Transformation
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)
2008.8.21
8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、
さらに1h培養した。
UV照射実験(プレート編)(~24日)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた。
コロニー数
AHLなし | AHL100nM | |
9h | 606 | 453 |
12h | 146 | 151 |
AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK
2008.8.22
mini prep:Mini prep
2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。
insert check:Digestion
BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
混ぜ表
double | simgle | |
dH2O | 14 | 25 |
10×BSA | 7 | 10 |
10×NE | 7 | 10 |
EcoRI | 3.5 | 5 |
PstI | 3.5 | - |
UV照射実験(液体編)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ105希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。
37℃で12h培養した後のコロニー数
AHLなし | AHL100nM | |
15min | 136 | 0? |
4h | 40 | 31 |
8h | 10 | 0 |
12h | 0 | 0 |
いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。
2008.8.25
BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり
プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
OD=0.495培養液 | 0.67μl |
60%グリセロール | 0.33μl |
20%グリセロールストック(計) | 1.00ml |
2008.8.28
transformation:Transformation
BBa_I7106(2007)
生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):Mini prep
→Digestion:Digestion
混ぜ表
double | |
dH2O | 2 |
10×BSA | 1 |
10×NE | 1 |
EcoRI | 0.5 |
PstI | 0.5 |
DNA | 5 |
TOTAL | 10 |
Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl
PCR:PCR
RBS+CI
混ぜ表
DNA | 1 |
FW primer | 2.5 |
VR primer | 2.5 |
dNTPmix | 5 |
thermo pol buffer | 5 |
DNA pol(VENT) | 1 |
dH2O | 34 |
TOTAL | 50 |
ゲルチェック:Gel Check
PCR産物 | 1 |
Dye | 1 |
dH2O | 4 |
TOTAL | 6 |
→濃度は33.6ng/μg
ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表
DNA | 1 |
FW primer | 5 |
VR primer | 5 |
dNTPmix | 10 |
thermo pol buffer | 10 |
DNA pol(VENT) | 1 |
dH2O | 68 |
TOTAL | 100 |
ゲルチェック:Gel Check
PCR産物 | 1 |
Dye | 1 |
dH2O | 4 |
TOTAL | 6 |
→バンド出ず。
2008.8.30
Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 6 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
XbaI | 2 |
DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
TOTAL | 60 |
→30μlゲル抽出
→ゲル抽出:Gel Extract
→Zymo:Zymo Clean
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 4 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
SpeI | 4 |
DNA | 75ng/μl×30μl(2μg) |
TOTAL | 60 |
→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extract
→Zymo:Zymo Clean
→SAP:SAP
混ぜ表
dH2O | 9 |
DNA | 10 |
SAP | 1 |
SAP Buffer | 10 |
TOTAL | 30 |
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
Ligation:Ligation
混ぜ表
- | b.g | |
dH2O | 1.4 | 8 |
Ligase | 1 | 1 |
Ligase Buffer | 2 | 2 |
Vector | 1.8 | 1 |
Insert | 3 | - |
TOTAL | 10 | 10 |
→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)
コロニーPCR(16コつつく):PCR
混ぜ表
VF | 2 |
VFR | 2 |
dNTP | 2 |
thermo pol buffer | 2 |
Tag | 0.3 |
dH2O | 11.7 |
TOTAL | 20 |
→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini prep
Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 6 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
XbaI | 2 |
DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
TOTAL | 60 |
ゲル抽出:Gel Extract
混ぜ表
Digestion産物 | 30 |
Dye | 6 |
TOTAL | 36 |
→Zymo:Zymo Clean
→NFW5μlで溶出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表
dH2O | 4 |
DNA | 1 |
Dye | 1 |
TOTAL | 6 |
→ゲルチェックOK
Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 4 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
SpeI | 4 |
DNA | 75ng/μl×30μl(2.25μg) |
TOTAL | 60 |
ゲル抽出:Gel Extract
混ぜ表
Digestion産物 | 30 |
Dye | 6 |
TOTAL | 36 |
→Zymo:Zymo Clean
→NFW10μlで溶出
→SAP:SAP
混ぜ表
dH2O | 9 |
DNA | 10 |
SAP | 1 |
SAP Buffer(×10) | 10 |
TOTAL | 30 |
→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
→Zymo:Zymo Clean
→NFW5μlで抽出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表
dH2O | 4 |
DNA | 1 |
Dye | 1 |
TOTAL | 6 |
→ゲルチェックOK
Ligation:Ligation
混ぜ表
- | b.g | |
dH2O | 1.4 | 8 |
Ligase | 1 | 1 |
Ligase Buffer | 2 | 2 |
Vector | 1.8 | 1 |
Insert | 3 | - |
TOTAL | 10 | 10 |
→25℃で2h放置
→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)