Team:Chiba/notebook/input/august

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Revision as of 04:54, 24 October 2008

８月の実験ログ

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2008.8.20

PCR

[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)①
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2008)②
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)③
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2008)④
[http://partsregistry.org/Part:BBa_E0612 BBa_E0612](2008)⑤

>

Sample No	①	②	③	④	⑤
DNA tamplate	1	1	1	1	1
FW primer	5	5	5	5	5
VR primer	5	5	5	5	5
dNTPmix	10	10	10	10	10
thermo pol buffer	10	10	10	10	10
DNA pol(VENT)	1	1	1	1	1
dH2O	68	68	68	68	68
TOTAL	100	100	100	100	100

-->Gel Check

>

Sample No.	①	②	③	④	⑤
Sample DNA	1	1	1	1	1
loading dye	1	1	1	1	1
dH₂O	4	4	4	4	4
Total	6	6	6	6	6

→どれもバンド出ず。

Transformation

[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの

[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、さらに1h培養した。

UV照射実験(プレート編)(~24日)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを10⁵希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに10⁵希釈して20μl撒いた。

コロニー数

	AHLなし	AHL100nM
9h	606	453
12h	146	151

AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK

2008.8.22

Mini prep

2ml培養した

[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

をミニプレした。

insert check:Digestion

[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)

[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)と[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

	double	simgle
dH₂O	14	25
10×BSA	7	10
10×NE	7	10
EcoRI	3.5	5
PstI	3.5	-

UV照射実験(液体編)(~24)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ10⁵希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。

37℃で12h培養した後のコロニー数

	AHLなし	AHL100nM
15min	136	0?
4h	40	31
8h	10	0
12h	0	0

いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。

2008.8.25

[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。

OD=0.495培養液	0.67μl
60%グリセロール	0.33μl
20%グリセロールストック(計)	1.00ml

2008.8.28

Transformation

[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106](2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してMini prep(60mlで溶出):

->Digestion
混ぜ表

	double
dH₂O	2
10×BSA	1
10×NE	1
EcoRI	0.5
PstI	0.5
DNA	5
TOTAL	10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl

PCR
RBS＋CI
混ぜ表


DNA	1
FW primer	2.5
VR primer	2.5
dNTPmix	5
thermo pol buffer	5
DNA pol(VENT)	1
dH2O	34
TOTAL	50

ゲルチェック

PCR産物	1
Dye	1
dH₂O	4
TOTAL	6

->濃度は33.6ng/μg

ベクターのPCR
[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106]
混ぜ表


DNA	1
FW primer	5
VR primer	5
dNTPmix	10
thermo pol buffer	10
DNA pol(VENT)	1
dH2O	68
TOTAL	100

ゲルチェック

PCR産物	1
Dye	1
dH₂O	4
TOTAL	6

->バンド出ず。

2008.8.30

Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表

	double
dH₂O	6
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
XbaI	2
DNA	33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL	60

->30μlゲル抽出

->ゲル抽出

->Zymo Clean

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表

	double
dH₂O	4
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
SpeI	4
DNA	75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL	60

->30μlゲル抽出

ゲル抽出

->Zymo Clean

->SAP

混ぜ表


dH₂O	9
DNA	10
SAP	1
SAP Buffer	10
TOTAL	30

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Ligation

混ぜ表

	-	b.g
dH₂O	1.4	8
Ligase	1	1
Ligase Buffer	2	2
Vector	1.8	1
Insert	3	-
TOTAL	10	10

->Transformation(XL10G) ->CFU40(b.gは22)

コロニーPCR(16コつつく):PCR

混ぜ表


VF	2
VFR	2
dNTP	2
thermo pol buffer	2
Tag	0.3
dH₂O	11.7
TOTAL	20

->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。

->Mini prep

Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表

	double
dH₂O	6
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
XbaI	2
DNA	33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL	60

Gel Extract

混ぜ表


Digestion産物	30
Dye	6
TOTAL	36

->Zymo Clean

->NFW5μlで溶出

->Gel Check

混ぜ表


dH₂O	4
DNA	1
Dye	1
TOTAL	6

->Gel Check->OK

Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表

	double
dH₂O	4
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
SpeI	4
DNA	75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL	60

Gel Extract

混ぜ表


Digestion産物	30
Dye	6
TOTAL	36

->Zymo Clean

->NFW10μlで溶出

->SAP

混ぜ表


dH₂O	9
DNA	10
SAP	1
SAP Buffer(×10)	10
TOTAL	30

->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,

->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX ->Zymo Clean

->NFW5μlで抽出

Gel Check

混ぜ表


dH₂O	4
DNA	1
Dye	1
TOTAL	6

→ゲルチェックOK

Ligation

混ぜ表

	-	b.g
dH₂O	1.4	8
Ligase	1	1
Ligase Buffer	2	2
Vector	1.8	1
Insert	3	-
TOTAL	10	10

->25℃で2h放置 ->Transformation(XL10G):

->CFU40(b.gは22)

@@ Line 404: / Line 404: @@
 == 2008.8.30 ==
-<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-<BR>x-RBS-cI-s-p(780bp)
-<BR>混ぜ表
+x-RBS-cI-s-p(780bp)
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 439: / Line 441: @@
 </tr>
 </table>
-→30μlゲル抽出
+->30μlゲル抽出
-<BR>→ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
-<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+<br>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
-<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+混ぜ表
-<BR>
-<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-<BR>-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
-<BR>混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 480: / Line 487: @@
 </tr>
 </table>
-→30μlゲル抽出
+->30μlゲル抽出
-<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
-<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]'''
-<BR>混ぜ表
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 513: / Line 523: @@
 μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
-<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
-<BR>混ぜ表
+'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
+混ぜ表
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 543: / Line 555: @@
 </tr>
 </table>
-→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
-<BR>→CFU40(b.gは22)
-<BR>コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G)
-<BR>混ぜ表
+->CFU40(b.gは22)
+コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <tr>
@@ Line 573: / Line 589: @@
 </tr>
 <tr>
-<td>dH2O</td>
+<td>dH<sub>2</sub>O</td>
 <td>11.7</td>
 </tr>
@@ Line 581: / Line 597: @@
 </tr>
 </table>
-→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
+->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
-<BR>→mini prep:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
+'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+x-RBS-cI-s-p(780bp)
-<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+混ぜ表
-<BR>x-RBS-cI-s-p(780bp)
-<BR>混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 623: / Line 642: @@
 </tr>
 </table>
-<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
-<BR>混ぜ表
+'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 641: / Line 662: @@
 </tr>
 </table>
-<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-<BR>→NFW5μlで溶出
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+->NFW5μlで溶出
+->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 667: / Line 691: @@
 </tr>
 </table>
-→ゲルチェックOK
+->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''->OK
-<BR>
-<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-<BR>-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
-<BR>混ぜ表
+'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 705: / Line 733: @@
 </table>
-<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 723: / Line 752: @@
 </tr>
 </table>
-<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-<BR>→NFW10μlで溶出
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+->NFW10μlで溶出
-<BR>混ぜ表
+->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 754: / Line 786: @@
 </tr>
 </table>
-→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
+->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
-<BR>→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
-<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
+->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+->NFW5μlで抽出
+'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
-→NFW5μlで抽出
-<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="57"></td>
@@ Line 784: / Line 819: @@
 →ゲルチェックOK
-<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
+'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 814: / Line 850: @@
 </tr>
 </table>
-→25℃で2h放置
+->25℃で2h放置
-→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
+->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G):
-<BR>→CFU40(b.gは22)
-<BR><BR>
+->CFU40(b.gは22)

Team:Chiba/notebook/input/august

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Revision as of 04:54, 24 October 2008

Contents

2008.8.20

2008.8.21

2008.8.22

2008.8.25

2008.8.28

2008.8.30