Team:Chiba/notebook/input/august
From 2008.igem.org
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== 2008.8.20== | == 2008.8.20== | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]''' | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)① | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2008)② | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)③ | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2008)④ | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_E0612 BBa_E0612](2008)⑤ | |
<table width="250" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="250" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td width="257">Sample No</td> | + | <td width="257">Sample No.</td> |
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td> | <td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 41: | Line 41: | ||
</tr> | </tr> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td> | + | <td>dH<sub>2</sub>O</td> |
<td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td> | <td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 49: | Line 49: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | ||
+ | -->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]''' | ||
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td width="257">Sample No</td> | + | <td width="257">Sample No.</td> |
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td> | <td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 75: | Line 76: | ||
</table> | </table> | ||
- | |||
+ | -->どれもバンド出ず。 | ||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]''' | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007) | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006) | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007) | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006) | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007) | ||
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007) | ||
- | + | -->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ) | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
== 2008.8.21 == | == 2008.8.21 == | ||
8.20にtransformationしたもの | 8.20にtransformationしたもの | ||
- | + | ||
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007) | |
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007) | ||
+ | |||
を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 | を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 | ||
さらに1h培養した。 | さらに1h培養した。 | ||
- | < | + | <br>UV照射実験(プレート編)(~24日) |
- | < | + | <br>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。 |
- | < | + | <br>グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。 |
+ | <br>37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを10<sup>5</sup>希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。 | ||
+ | <br>37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。 | ||
+ | <br>UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。 | ||
+ | <br>両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。 | ||
+ | <br>37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに10<sup>5</sup>希釈して20μl撒いた。 | ||
+ | |||
+ | |||
+ | コロニー数 | ||
+ | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
+ | <td width="257"></td> | ||
+ | <td>AHLなし</td><td>AHL100nM</td> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>9h</td> | ||
+ | <td>606</td><td>453</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>12h</td> | ||
+ | <td>146</td><td>151</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | </table> | ||
+ | |||
+ | |||
+ | AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK | ||
== 2008.8.22 == | == 2008.8.22 == | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]''' | |
<BR>2ml培養した | <BR>2ml培養した | ||
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007) | |
- | + | ||
- | + | をミニプレした。 | |
- | + | insert check:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | |
- | + | ||
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007) | |
- | + | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006) | |
+ | *[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007) | ||
+ | |||
+ | [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)と[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。 | ||
<BR> | <BR> | ||
<BR>混ぜ表 | <BR>混ぜ表 | ||
Line 154: | Line 180: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
+ | |||
+ | <BR>UV照射実験(液体編)(~24) | ||
+ | <BR>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。 | ||
+ | <BR>グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM) | ||
+ | <BR>37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。 | ||
+ | <BR>UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ10<sup>5</sup>希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。 | ||
+ | |||
+ | <BR>37℃で12h培養した後のコロニー数 | ||
+ | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
+ | <td width="257"></td> | ||
+ | <td>AHLなし</td><td>AHL100nM</td> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>15min</td> | ||
+ | <td>136</td><td>0?</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>4h</td> | ||
+ | <td>40</td><td>31</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>8h</td> | ||
+ | <td>10</td><td>0</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | <tr> | ||
+ | <td>12h</td> | ||
+ | <td>0</td><td>0</td> | ||
+ | </tr> | ||
+ | </table> | ||
+ | <BR> | ||
+ | いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。 | ||
== 2008.8.25 == | == 2008.8.25 == | ||
- | BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり | + | [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](insert check済み)のグリセロールストックづくり |
<BR><BR>プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h) | <BR><BR>プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h) | ||
<BR>培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。 | <BR>培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。 | ||
Line 172: | Line 228: | ||
</table> | </table> | ||
+ | == 2008.8.28 == | ||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]''' | ||
- | + | [http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106](2007) | |
- | + | 生えてきたコロニーを10ml培養して'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''(60mlで溶出): | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | |
- | + | <br>混ぜ表 | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | < | + | |
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 221: | Line 268: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | Digestion 37℃、30分 | + | '''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' 37℃、30分 |
<BR>プラスミドの濃度は33.6ng/μl | <BR>プラスミドの濃度は33.6ng/μl | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]''' | |
<BR>RBS+CI | <BR>RBS+CI | ||
<BR>混ぜ表 | <BR>混ぜ表 | ||
Line 258: | Line 305: | ||
</tr> | </tr> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td> | + | <td>dH<sub>2</sub>O</td> |
<td>34</td> | <td>34</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 267: | Line 314: | ||
</table> | </table> | ||
- | + | ||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|ゲルチェック]]''' | ||
Line 288: | Line 336: | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->濃度は33.6ng/μg | |
- | + | ||
- | < | + | ベクターの'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]''' |
- | < | + | <br>[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106] |
+ | <br>混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<tr> | <tr> | ||
Line 322: | Line 371: | ||
</tr> | </tr> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td> | + | <td>dH<sub>2</sub>O</td> |
<td>68</td> | <td>68</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 331: | Line 380: | ||
</table> | </table> | ||
- | + | ||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|ゲルチェック]]''' | ||
Line 343: | Line 393: | ||
</tr> | </tr> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td>dH< | + | <td>dH<sub>2</sub>O</td> |
<td>4</td> | <td>4</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 351: | Line 401: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->バンド出ず。 | |
== 2008.8.30 == | == 2008.8.30 == | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | |
- | + | ||
- | + | x-RBS-cI-s-p(780bp) | |
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 389: | Line 441: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->30μlゲル抽出 | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]''' | |
- | + | ||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]''' | |
- | + | ||
- | + | ||
+ | 5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用 | ||
+ | |||
+ | |||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | ||
+ | |||
+ | -e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp) | ||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 430: | Line 488: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->30μlゲル抽出 | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]''' | |
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]''' | |
+ | |||
+ | -->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]''' | ||
+ | |||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 461: | Line 522: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | 5μ抽出, | + | 5μ抽出,うち1μlをゲルチェック |
- | + | -->OK,4μlはLigation用 | |
- | + | ||
+ | |||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]''' | ||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 493: | Line 558: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | |||
- | |||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G) | |
- | + | ||
+ | -->CFU40(b.gは22) | ||
+ | |||
+ | |||
+ | コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]''' | ||
+ | |||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<tr> | <tr> | ||
Line 523: | Line 593: | ||
</tr> | </tr> | ||
<tr> | <tr> | ||
- | <td> | + | <td>dH<sub>2</sub>O</td> |
<td>11.7</td> | <td>11.7</td> | ||
</tr> | </tr> | ||
Line 531: | Line 601: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。 | |
- | + | ||
+ | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]''' | ||
- | + | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | |
- | + | ||
+ | x-RBS-cI-s-p(780bp) | ||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 573: | Line 646: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]''' | |
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 591: | Line 666: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | |||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]''' | |
- | + | ||
- | + | -->NFW5μlで溶出 | |
+ | |||
+ | -->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]''' | ||
+ | |||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 617: | Line 695: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''-->OK | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' | |
+ | |||
+ | -e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp) | ||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
Line 655: | Line 737: | ||
</table> | </table> | ||
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]''' | |
- | + | ||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 673: | Line 756: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | |||
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]''' | |
- | + | -->NFW10μlで溶出 | |
- | + | ||
+ | -->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]''' | ||
+ | |||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 704: | Line 790: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min, | |
- | + | ||
- | + | ||
- | + | -->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX | |
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]''' | |
- | + | -->NFW5μlで抽出 | |
+ | |||
+ | '''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]''' | ||
+ | |||
+ | |||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="57"></td> | <td width="57"></td> | ||
Line 732: | Line 821: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->ゲルチェックOK | |
- | + | '''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]''' | |
- | + | ||
+ | 混ぜ表 | ||
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000"> | ||
<td width="257"></td> | <td width="257"></td> | ||
- | <td></td><td>b.g</td> | + | <td>-</td><td>b.g</td> |
<tr> | <tr> | ||
<td>dH<sub>2</sub>O</td> | <td>dH<sub>2</sub>O</td> | ||
Line 764: | Line 854: | ||
</tr> | </tr> | ||
</table> | </table> | ||
- | + | -->25℃で2h放置 | |
- | + | -->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G): | |
- | + | ||
- | + | -->CFU40(b.gは22) |
Latest revision as of 05:02, 24 October 2008
8月の実験ログ
Contents |
2008.8.20
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)①
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2008)②
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)③
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2008)④
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_E0612 BBa_E0612](2008)⑤
Sample No. | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
DNA tamplate | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
FW primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
VR primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
dNTPmix | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
thermo pol buffer | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
DNA pol(VENT) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
dH2O | 68 | 68 | 68 | 68 | 68 |
TOTAL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
-->Gel Check
Sample No. | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
Sample DNA | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
loading dye | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
dH2O | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Total | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
-->どれもバンド出ず。
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
-->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)
2008.8.21
8.20にtransformationしたもの
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。
UV照射実験(プレート編)(~24日)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた。
コロニー数
AHLなし | AHL100nM | |
9h | 606 | 453 |
12h | 146 | 151 |
AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK
2008.8.22
2ml培養した
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
をミニプレした。
insert check:Digestion
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)と[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
混ぜ表
double | simgle | |
dH2O | 14 | 25 |
10×BSA | 7 | 10 |
10×NE | 7 | 10 |
EcoRI | 3.5 | 5 |
PstI | 3.5 | - |
UV照射実験(液体編)(~24)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ105希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。
37℃で12h培養した後のコロニー数
AHLなし | AHL100nM | |
15min | 136 | 0? |
4h | 40 | 31 |
8h | 10 | 0 |
12h | 0 | 0 |
いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。
2008.8.25
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](insert check済み)のグリセロールストックづくり
プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
OD=0.495培養液 | 0.67μl |
60%グリセロール | 0.33μl |
20%グリセロールストック(計) | 1.00ml |
2008.8.28
[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106](2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してMini prep(60mlで溶出):
-->Digestion
混ぜ表
double | |
dH2O | 2 |
10×BSA | 1 |
10×NE | 1 |
EcoRI | 0.5 |
PstI | 0.5 |
DNA | 5 |
TOTAL | 10 |
Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl
PCR
RBS+CI
混ぜ表
DNA | 1 |
FW primer | 2.5 |
VR primer | 2.5 |
dNTPmix | 5 |
thermo pol buffer | 5 |
DNA pol(VENT) | 1 |
dH2O | 34 |
TOTAL | 50 |
PCR産物 | 1 |
Dye | 1 |
dH2O | 4 |
TOTAL | 6 |
-->濃度は33.6ng/μg
ベクターのPCR
[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106]
混ぜ表
DNA | 1 |
FW primer | 5 |
VR primer | 5 |
dNTPmix | 10 |
thermo pol buffer | 10 |
DNA pol(VENT) | 1 |
dH2O | 68 |
TOTAL | 100 |
PCR産物 | 1 |
Dye | 1 |
dH2O | 4 |
TOTAL | 6 |
-->バンド出ず。
2008.8.30
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 6 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
XbaI | 2 |
DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
TOTAL | 60 |
-->30μlゲル抽出
-->ゲル抽出
-->Zymo Clean
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 4 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
SpeI | 4 |
DNA | 75ng/μl×30μl(2μg) |
TOTAL | 60 |
-->30μlゲル抽出
-->Zymo Clean
-->SAP
混ぜ表
dH2O | 9 |
DNA | 10 |
SAP | 1 |
SAP Buffer | 10 |
TOTAL | 30 |
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック
-->OK,4μlはLigation用
混ぜ表
- | b.g | |
dH2O | 1.4 | 8 |
Ligase | 1 | 1 |
Ligase Buffer | 2 | 2 |
Vector | 1.8 | 1 |
Insert | 3 | - |
TOTAL | 10 | 10 |
-->Transformation(XL10G)
-->CFU40(b.gは22)
コロニーPCR(16コつつく):PCR
混ぜ表
VF | 2 |
VFR | 2 |
dNTP | 2 |
thermo pol buffer | 2 |
Tag | 0.3 |
dH2O | 11.7 |
TOTAL | 20 |
-->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
-->Mini prep
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 6 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
XbaI | 2 |
DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
TOTAL | 60 |
混ぜ表
Digestion産物 | 30 |
Dye | 6 |
TOTAL | 36 |
-->Zymo Clean
-->NFW5μlで溶出
-->Gel Check
混ぜ表
dH2O | 4 |
DNA | 1 |
Dye | 1 |
TOTAL | 6 |
-->Gel Check-->OK
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
double | |
dH2O | 4 |
10×BSA | 10 |
10×NE | 10 |
PstI | 2 |
SpeI | 4 |
DNA | 75ng/μl×30μl(2.25μg) |
TOTAL | 60 |
混ぜ表
Digestion産物 | 30 |
Dye | 6 |
TOTAL | 36 |
-->Zymo Clean
-->NFW10μlで溶出
-->SAP
混ぜ表
dH2O | 9 |
DNA | 10 |
SAP | 1 |
SAP Buffer(×10) | 10 |
TOTAL | 30 |
-->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
-->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX -->Zymo Clean
-->NFW5μlで抽出
混ぜ表
dH2O | 4 |
DNA | 1 |
Dye | 1 |
TOTAL | 6 |
-->ゲルチェックOK
混ぜ表
- | b.g | |
dH2O | 1.4 | 8 |
Ligase | 1 | 1 |
Ligase Buffer | 2 | 2 |
Vector | 1.8 | 1 |
Insert | 3 | - |
TOTAL | 10 | 10 |
-->25℃で2h放置 -->Transformation(XL10G):
-->CFU40(b.gは22)