Team:Chiba/Demo experiments
From 2008.igem.org
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4=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(low copy) | 4=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(low copy) | ||
- | 5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP | + | 5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP(high copy) |
6=N.C | 6=N.C |
Revision as of 18:17, 29 October 2008
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Contents |
Demo Experiment ~Senders~
Method
- プレ培養
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], (BW)
- LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), (XL10G)
- LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)]), (XL10G)
- 37°Cでしんとう培養。12h
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- 本培養
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
- LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)])
- 37°Cでしんとう培養。4~5h。
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- Wash
- 遠心管50mL中に10mLずつ培養液を移す。
- 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Ampを加える。
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]が入った各遠心管に10mL
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管に5mL
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを5mL添加
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを10mLずつ添加
- Mix
- Senderの[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]と[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]を、それぞれ1:1で[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]と混ぜる。
- 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
- 緑の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
- 赤の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
- 無地の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]のみ
- 培養&観察
Results
Green region: sender=LuxI, Red circular region: sender=Las I.
1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼(蛍光灯光)で確認。3枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。
(それぞれ0時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験(1000μL)での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。)
--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)
Demo Experiment ~Receivers~
method-菌数ふり実験
- Receiver(T9002)のプレ培養
- Receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW)をLB-Amp 2ml培養(37°C,12h)
- プレ培養したReceiver([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))をコロニーが1000個くらいになるようにプレートにまく。
- Sender(S03623)のプレ培養
- Sender:[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
- senderのWash
- 培養液([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
- 同様の操作をあと2回行った。
- 固体プレート作り
- LB-Ampで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-2を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-3を作る。
- ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
- ニトロセルロースでリフト
- Receiver([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
- GFPの確認方法
- 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。
香取
method-いろんなレシーバー実験
- Receiver&senderのプレ培養
- 用いたReceiverは
・[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)
・ptet-luxR-(low copy),[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 BBa_J37032]:plux-GFP(high copy)
・[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)
・ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP
・ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA (すべてBW)をLB 2ml培養(37°C,12h)プレ培養したそれぞれのReceiverをコロニーが1000個くらいになるようにプレートにまく。
- Sender:[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW)をLB 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)
- senderのWash
- 各receiverの培養液を50mL遠心管でde20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB10mlを加える。
- 同様の操作をあと2回行った。
- 固体プレート作り
- LBで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-1(10ml)とLB-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
- LBで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-2(100μl)をLB(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLBagar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-2を作る。
- LBで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-3を作る。
- ニトロセルロースでリフト
- 各Receiverのcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)receiverの種類によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
- GFPの確認方法
- 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。
result and discussion-菌数ふり実験
0h 0.5h 1.5h
0h 0.5h 1.5h 2.0h
0h 0.5h 1.5h 2.0h 2.5h
result and discussion-いろんなレシーバー実験
0h 0.5h 1.0h 1.5h
1=N.C
2=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)
3=ptet-luxR-(low copy),[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 BBa_J37032]:plux-GFP(high copy)
4=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)
5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP(high copy)
6=N.C
7=ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA
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