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8月の実験ログ

9月の実験ログはこちらから。
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Contents

2008.8.20

PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤

>
Sample No
DNA tamplate 11111
FW primer 55555
VR primer 55555
dNTPmix 1010101010
thermo pol buffer 1010101010
DNA pol(VENT) 11111
dH2O 6868686868
TOTAL 100100100100100


→gel check:Gel Check


>
Sample No
Sample DNA 11111
loading dye 11111
dH2O 44444
Total 66666

→どれもバンド出ず。




trnsformation:Transformation


・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)

→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007) を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。



UV照射実験(プレート編)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-(BWΔtdk)の2plasmidのものを使用。
グリストをつついて、AHL(100nM)を

2008.8.22

mini prep:Mini prep


2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。


insert check:Digestion


BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

doublesimgle
dH2O 1425
10×BSA 710
10×NE 710
EcoRI 3.55
PstI 3.5-

2008.8.25

BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。


OD=0.495培養液 0.67μl
60%グリセロール 0.33μl
20%グリセロールストック(計) 1.00ml



UV照射実験
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた。



コロニー数

AHLなしAHL100nM
9h 606453
12h 146151

2008.8.28

transformation:Transformation
BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):Mini prep


→Digestion:Digestion
混ぜ表

double
dH2O 2
10×BSA 1
10×NE 1
EcoRI 0.5
PstI 0.5
DNA 5
TOTAL 10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl



PCR:PCR
RBS+CI
混ぜ表

DNA 1
FW primer 2.5
VR primer 2.5
dNTPmix 5
thermo pol buffer 5
DNA pol(VENT) 1
dH2O 34
TOTAL 50


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→濃度は33.6ng/μg


ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表

DNA 1
FW primer 5
VR primer 5
dNTPmix 10
thermo pol buffer 10
DNA pol(VENT) 1
dH2O 68
TOTAL 100


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→バンド出ず。

2008.8.30


Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
→ゲル抽出:Gel Extract
→Zymo:Zymo Clean


5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extract
→Zymo:Zymo Clean


→SAP:SAP


混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer 10
TOTAL 30

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用


Ligation:Ligation
混ぜ表

-b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)


コロニーPCR(16コつつく):PCR
混ぜ表

VF 2
VFR 2
dNTP 2
thermo pol buffer 2
Tag 0.3
dH2O 11.7
TOTAL 20

→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini prep




Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60


ゲル抽出:Gel Extract
混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36


→Zymo:Zymo Clean


→NFW5μlで溶出
ゲルチェック:Gel Check


混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

→ゲルチェックOK

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL 60


ゲル抽出:Gel Extract
混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36


→Zymo:Zymo Clean


→NFW10μlで溶出


→SAP:SAP


混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer(×10) 10
TOTAL 30

→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
→Zymo:Zymo Clean

→NFW5μlで抽出
ゲルチェック:Gel Check


混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

→ゲルチェックOK


Ligation:Ligation
混ぜ表

-b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→25℃で2h放置 →Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)