Team:Chiba/Demo experiments
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1=N.C | 1=N.C |
Revision as of 16:26, 29 October 2008
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Contents |
Demo Experiment ~Senders~
Method
- プレ培養
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- LB-Amp, BBa_T9002, (BW)
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), (XL10G)
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA)), (XL10G)
- 37°Cでしんとう培養。12h
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- 本培養
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- LB-Amp, BBa_T9002
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA))
- 37°Cでしんとう培養。4~5h。
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- Wash
- 遠心管50mL中に10mLずつ培養液を移す。
- 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Ampを加える。
- BBa_T9002が入った各遠心管に10mL
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管に5mL
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを5mL添加
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを10mLずつ添加
- Mix
- SenderのBBa_K084012とBBa_K084007を、それぞれ1:1でBBa_T9002と混ぜる。
- 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
- 緑の部分にBBa_K084012:BBa_T9002=1:1
- 赤の部分にBBa_K084007:BBa_T9002=1:1
- 無地の部分にBBa_T9002のみ
- 培養&観察
Results
Green region: sender=LuxI, Red circular region: sender=Las I.
1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼(蛍光灯光)で確認。3枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。
(それぞれ0時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験(1000μL)での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。)
--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)
Demo Experiment ~Receivers~
method-菌数ふり実験
- Receiver(T9002)のプレ培養
- Sender(S03623)のプレ培養
- Sender:BBa_S03623(BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
- senderのWash
- 培養液(BBa_T9002(BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
- 同様の操作をあと2回行った。
- 固体プレート作り
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-2を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-3を作る。
- ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
- ニトロセルロースでリフト
- Receiver(BBa_T9002(BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender(BBa_S03623(BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
- GFPの確認方法
- 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。
香取
method-いろんなレシーバー実験
- Receiver(T9002)のプレ培養
- Sender(S03623)のプレ培養
- Sender:BBa_S03623(BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
- senderのWash
- 培養液(BBa_T9002(BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
- 同様の操作をあと2回行った。
- 固体プレート作り
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-2を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-3を作る。
- ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
- ニトロセルロースでリフト
- Receiver(BBa_T9002(BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender(BBa_S03623(BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
- GFPの確認方法
- 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。
result-菌数ふり実験
0h 0.5h 1.5h
0h 0.5h 1.5h 2.0h
0h 0.5h 1.5h 2.0h 2.5h
result-いろんなレシーバー実験
0h 0.5h 1.0h 1.5h
1=N.C
2=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)
3=ptet-luxR-(low copy),BBa_J37032:plux-GFP(high copy)
4=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)
5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP
6=N.C
7=ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA
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