Team:Chiba/Demo experiments

From 2008.igem.org

Revision as of 17:08, 29 October 2008

Demo Experiment ~Senders~

Method

1. プレ培養
   1. 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
      1. LB-Amp, BBa_T9002, (BW)
      2. LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), (XL10G)
      3. LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA)), (XL10G)
   2. 37°Cでしんとう培養。12h
2. 本培養
   1. プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
      1. LB-Amp, BBa_T9002
      2. LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA))
   2. 37°Cでしんとう培養。4～5h。
3. Wash
   1. 遠心管50mL中に10mLずつ培養液を移す。
   2. 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
   3. 各遠心管にLB-Ampを加える。
      1. BBa_T9002が入った各遠心管に10mL
      2. BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管に5mL
   4. BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
   5. BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを5mL添加
   6. BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
   7. BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを10mLずつ添加
4. Mix
   1. SenderのBBa_K084012とBBa_K084007を、それぞれ1：1でBBa_T9002と混ぜる。
   2. 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
      1. 緑の部分にBBa_K084012:BBa_T9002=1:1
      2. 赤の部分にBBa_K084007:BBa_T9002=1:1
      3. 無地の部分にBBa_T9002のみ
5. 培養＆観察

Results

Green region: sender=LuxI, Red circular region: sender=Las I.

0 h

4 h (Lux I GFP detected)

8 h (Lux I GFP and Las I GFP detected)

1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼（蛍光灯光）で確認。３枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。

（それぞれ０時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験（1000μL）での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。）

--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)

Demo Experiment ~Receivers~

method-菌数ふり実験

1. Receiver(T9002)のプレ培養
   1. Receiver:BBa_T9002(BW)をLB-Amp 2ml培養(37°C,12h)
   2. プレ培養したReceiver(BBa_T9002(BW))をコロニーが1000個くらいになるようにプレートにまく。
2. Sender(S03623)のプレ培養
   1. Sender:BBa_S03623(BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
3. senderのWash
   1. 培養液(BBa_T9002(BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
   2. 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
   3. 同様の操作をあと2回行った。
4. 固体プレート作り
   1. LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
   2. LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-2を作る。
   3. LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-3を作る。
   4. ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
5. ニトロセルロースでリフト
   1. Receiver(BBa_T9002(BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender(BBa_S03623(BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
6. GFPの確認方法
   1. 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。

香取

method-いろんなレシーバー実験

1. Receiver&senderのプレ培養
   1. 用いたReceiverは　　　

　　　　　・BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)

　　　　　・ptet-luxR-(low copy),BBa_J37032:plux-GFP(high copy)

　　　　　・BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)

　　　　　・ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP

　　　　　・ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA 　　　 　　　　　　　（すべてBW）をLB 2ml培養(37°C,12h)プレ培養したそれぞれのReceiverをコロニーが1000個くらいになるようにプレートにまく。

1. 1. Sender:BBa_S03623(BW)をLB 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)
2. senderのWash
   1. 各receiverの培養液を50mL遠心管でde20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
   2. 各遠心管にLB10mlを加える。
   3. 同様の操作をあと2回行った。
3. 固体プレート作り
   1. LBで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-1(10ml)とLB-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
   2. LBで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-2(100μl)をLB(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLBagar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-2を作る。
   3. LBで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-3を作る。
4. ニトロセルロースでリフト
   1. 各Receiverのcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender(BBa_S03623(BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)receiverの種類によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
5. GFPの確認方法
   1. 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。

result-菌数ふり実験

希釈なし

                 0h                        0.5h                        1.5h

１００倍希釈

                  0h                        0.5h                      1.5h                       2.0h

１０００倍希釈

                0h                   0.5h                1.5h             2.0h               2.5h

result-いろんなレシーバー実験

         0h                 0.5h                 　　　　　1.0h                1.5h

1=N.C

2=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)

3=ptet-luxR-(low copy),BBa_J37032:plux-GFP(high copy)

4=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)

5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP

6=N.C

7=ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA

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