Team:Chiba/Demo experiments
From 2008.igem.org
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Contents |
Demo Experiment ~Senders~
Method
- プレ培養
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- LB-Amp, BBa_T9002, (BW)
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), (XL10G)
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA)), (XL10G)
- 37°Cでしんとう培養。12h
- 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
- 本培養
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- LB-Amp, BBa_T9002
- LB-Amp+0.2%Glu, BBa_K084012(plac+rbs+LuxI(no LVA)), BBa_K084007(plac+rbs+LasI(no LVA))
- 37°Cでしんとう培養。4~5h。
- プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
- Wash
- 遠心管50mL中に10mLずつ培養液を移す。
- 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Ampを加える。
- BBa_T9002が入った各遠心管に10mL
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管に5mL
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを5mL添加
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
- BBa_K084012, BBa_K084007が入った各遠心管にLB-Ampを10mLずつ添加
- Mix
- SenderのBBa_K084012とBBa_K084007を、それぞれ1:1でBBa_T9002と混ぜる。
- 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
- 緑の部分にBBa_K084012:BBa_T9002=1:1
- 赤の部分にBBa_K084007:BBa_T9002=1:1
- 無地の部分にBBa_T9002のみ
- 培養&観察
Results
結果は以下の通り。
1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼(蛍光灯光)で確認。3枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。
(それぞれ0時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験(1000μL)での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。)
--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)
Demo Experiment ~Receivers~
method-菌数ふり実験
- Receiver(T9002)のプレ培養
- Sender(S03623)のプレ培養
- Sender:BBa_S03623(BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
- senderのWash
- 培養液(BBa_T9002(BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
- 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
- 同様の操作をあと2回行った。
- 固体プレート作り
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSender(BBa_S03623(BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-2を作る。
- LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender(BBa_S03623(BW))入りの固体培地-3を作る。
- ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
- ニトロセルロースでリフト
- Receiver(BBa_T9002(BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender(BBa_S03623(BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
- GFPの確認方法
- 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。
香取
method
result-菌数ふり実験
0h 0.5h 1.5h
0h 0.5h 1.5h 2.0h
0h 0.5h 1.5h 2.0h 2.5h
result
菌数ふり実験
0h 0.5h 1.5h
0h 0.5h 1.5h 2.0h
0h 0.5h 1.5h 2.0h 2.5h
いろんなレシーバー実験
0h 0.5h 1.0h 1.5h
1=N.C
2=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)
3=ptet-luxR-(low copy),BBa_J37032:plux-GFP(high copy)
4=BBa_T9002:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)
5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP
6=N.C
7=ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA
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