Team:Chiba/notebook/input/september

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== 2008.9.1 ==
== 2008.9.1 ==
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・Ptet+RBS+cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
+
*Ptet+RBS+cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
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<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
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*-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
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<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
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*-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
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<BR>結果→GFPが発現していた。
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*結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは?
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<BR>-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは?
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*ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
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<BR>→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
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*-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
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<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
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<BR>混ぜ表
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混ぜ表
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
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</table>
</table>
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<BR>UV照射テスト
 
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<BR>・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
 
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<BR>・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
 
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<BR>・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
 
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<BR>・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
 
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<BR>・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
 
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<BR>・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
 
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<BR>・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
 
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<BR>・37℃,12h後にコロニーを数える。
 
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<BR>コロニー数
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UV照射テスト
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*-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
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*グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
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*37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
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*小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
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*乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
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*UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
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*10<sup>4</sup>,10<sup>5</sup>希釈し、20μlをプレートに撒いた。
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*37℃,12h後にコロニーを数える。
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コロニー数
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
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== 2008.9.2 ==
== 2008.9.2 ==
UV照射実験
UV照射実験
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<BR>・Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
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*Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
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<BR>・37℃,12h後,ODを測定して10<sup>2</sup>~10<sup>3</sup>のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
+
*37℃,12h後,ODを測定して10<sup>2</sup>~10<sup>3</sup>のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
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<BR>・新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
+
*新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
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<BR>・PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
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*PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
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<BR>・UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ(2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用)のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
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*UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ(2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用)のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
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<BR>・それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
+
*それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
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<BR><BR>結果
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<BR>PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
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*結果
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::PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
== 2008.9.12 ==
== 2008.9.12 ==
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Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
+
*Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
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<BR>I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②~⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
+
 
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<BR>37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①~⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
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I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②~⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
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<BR>L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
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37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①~⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
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L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
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<BR>混ぜ表
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混ぜ表
<table width="100" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="100" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
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<BR>L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
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<BR>結果は以下のとおり。
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L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
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結果は以下のとおり。
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== 2008.9.13 ==
== 2008.9.13 ==
Time Delay Test
Time Delay Test
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<BR>①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
+
①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
-
<BR>②Plac-RhlI -Amp(BW)
+
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<BR>③Plac-LasI -Amp(BW)
+
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<BR>④Ptet-LuxI -Amp(BW)
+
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<BR>プレ培
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②Plac-RhlI -Amp(BW)
-
<BR>①LB-Kan 2ml培養
+
 
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<BR>②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
+
③Plac-LasI -Amp(BW)
-
<BR>④LB-Amp 2ml培養
+
 
-
<BR>↓over night
+
④Ptet-LuxI -Amp(BW)
-
<BR><本培>
+
 
-
<BR>50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
+
*プレ培
-
<BR>50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
+
①LB-Kan 2ml培養
-
<BR>50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
+
 
-
<BR>OD>2となったらWash
+
②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
-
<BR><BR>①に関して
+
 
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<BR>①                                     
+
④LB-Amp 2ml培養
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<BR>↓冷却遠心(3700rpm,3min)          
+
 
-
<BR>上澄みを捨てる                               
+
↓over night
-
<BR>LB-Kanを20ml加える。            
+
 
-
<BR><BR>②③④に関して                                   
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*本培
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<BR> ②、③、④
+
 
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<BR> ↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+
50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
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<BR>上澄みを捨てる。
+
 
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<BR>LBを2ml加える。            
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50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
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<BR>    ↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+
 
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<BR>上澄みを捨てる。                                             
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50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
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<BR>LBを2ml加える。
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<BR>    ↓冷却遠心(3700rom,3min)
+
OD>2となったらWash
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<BR>上澄み捨てる。
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<BR>LB-Ampを6ml加える。
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*①に関して
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①                                     
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↓冷却遠心(3700rpm,3min)          
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上澄みを捨てる                               
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LB-Kanを20ml加える。            
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*②③④に関して                                   
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②、③、④
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↓冷却遠心(3700rpm,3min)
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上澄みを捨てる。
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LBを2ml加える。            
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:::↓冷却遠心(3700rpm,3min)
 +
 
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上澄みを捨てる。                                             
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LBを2ml加える。
 +
 
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:::↓冷却遠心(3700rom,3min)
 +
 
 +
上澄み捨てる。
 +
 
 +
LB-Ampを6ml加える。
-
</table>
 
48欠Deep Well
48欠Deep Well
<table width="300" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="300" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">

Latest revision as of 05:09, 24 October 2008

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Contents

2008.9.1

  • Ptet+RBS+cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
  • -Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
  • -Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
  • 結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは?
  • ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
  • -Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

DoubleSingle
dH2O 12
XbaI 11
SpeI 1-
BSA(×10) 11
NEB(×10) 11
DNA 55
TOTAL 1010


UV照射テスト

  • -Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
  • グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
  • 37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
  • 小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
  • 乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
  • UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
  • 104,105希釈し、20μlをプレートに撒いた。
  • 37℃,12h後にコロニーを数える。


コロニー数

UV+ 104UV+ 105UV-104UV-105
0min 42374271156
10min 30151--
30min 1397--
1h 895104054
2h 51--
4h 2025450
6h 00--
8h 101155106

2008.9.2

UV照射実験

  • Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
  • 37℃,12h後,ODを測定して102~103のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
  • 新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
  • PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
  • UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ(2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用)のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
  • それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
  • 結果
PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。

2008.9.12

  • Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト

I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②~⑤)のコロニーをつついて2ml培養。

37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①~⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。


L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。

混ぜ表

20%L-アラビノース濃度
0μl0%(N.C)
1.9μl0.2%
19μl2%
190μl20%
-P.C

L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。

結果は以下のとおり。


L-アラビノース入れて30分後 8.8909.75210.109.4139.701
L-アラビノース入れて1h後 9.16113.9317.3714.9710.60
L-アラビノース入れて2h後 9.41727.9640.2529.8710.72
L-アラビノース入れて6h後 9.93374.99150.9125.010.04
L-アラビノース入れて12h後 10.6499.39202.8872.0811.76
L-アラビノース入れて24h後 14.66105.6447.333.3117.11

2008.9.13

Time Delay Test ①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)

②Plac-RhlI -Amp(BW)

③Plac-LasI -Amp(BW)

④Ptet-LuxI -Amp(BW)

  • プレ培

①LB-Kan 2ml培養

②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養

④LB-Amp 2ml培養

↓over night

  • 本培

50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。

50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。

50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。

OD>2となったらWash


  • ①に関して

↓冷却遠心(3700rpm,3min)          

上澄みを捨てる

LB-Kanを20ml加える。            


  • ②③④に関して

②、③、④

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。            

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。

↓冷却遠心(3700rom,3min)

上澄み捨てる。

LB-Ampを6ml加える。


48欠Deep Well

①:2ml ②:2ml,AHL②:2ml③:2ml④2ml-
- -----
①:1ml,②:1ml,IPTG:2μl ①:100μl,②:1ml,IPTG:1.1μl①10μl,②1ml,IPTG:101μl①:1μl,②1ml,IPTG:1.001μl①:1ml,②:100μl,IPTG:1.1μl①:1ml,②:10μl,IPTG:1.01μl
- -----
①:1ml,③:1ml,IPTG:2μl ①:100μl,③:1ml,IPTG:1.1μl①:10μl,③:1ml,IPTG:1.01μl①:1μl,③:1ml,IPTG①:1ml,③:100μl,IPTG:1.1μl①:1ml,③:10μl,IPTG:1.01μl
- -----
①:1ml,④:1ml,IPTG:2μl ①100μl,④:1ml,IPTG:1.1μl①:10μl,④:1ml,IPTG:1.0μl①:1μl,④:1ml,IPTG:1.001μl①:1ml,④:100μl,IPTG:1.0μl①:1ml,④:10μl,IPTG1.01μl
- -----