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Team:Chiba/protocol/DNA Purification/qia/j
From 2008.igem.org
QIAprep Spin Miniprep kit によるDNA精製プロトコル
- スピンダウンしたペレットに、Buffer:P1（冷蔵庫に保管）を200μL入れてボルテックスで懸濁
- Buffer:P2（アルカリ性）を250μL加え、４～６回チューブを転倒させる。溶液は青色に変化する。この時DNAが壊れてしまう可能性があるので優しく取り扱うこと。
- Buffer:N3（酸性）を350μL加え、すぐにチューブを４～６回転倒させて完全に混ぜる。（中和反応）沈殿が固まってしまうのを防ぐため、N3を加えたら溶液をすばやく優しくまぜる。
- 10分間、遠心機で13,000rpm設定で遠心。白い塊状のペレット（菌の死骸）が形成する。
- 4の上澄み液を直接、またはピペッティングによりQIAprepスピンカラムに入れる。
- 1分間遠心（13,000rpm）してカラムにDNAをつける。
- カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
- Buffer:PBを400μL入れてさらに1分間遠心（13,000rpm）。さらにDNA・プラスミドをカラムにくっつける。
- カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
- Buffer:PEを400μL入れて1分間遠心（13,000rpm）。QIAprepカラムをこの操作で洗浄する。
- 9～10の操作を繰り返す。
- 残っているBuffer:PEを除去するためにさらに1分間空遠心（13,000rpm）。PEのEtha-OHが残っていると後に続く酵素反応が阻害されてしまう。
- QIAprepのカラムを新しい1.5μLのマイクロ遠心チューブにセットする。この時、Etha-OHをとばすために少しだけ時間をおくとよい。
- Buffer:EBを100μLを各カラムの中央に敵かし１分間静置。ここでカラムからDNAの溶出を行う。
- 1分間遠心（13,000rpm）し、カラムをはずしてチューブの蓋を閉めたらミニプレ完了！
