Team:Chiba/Project/Experiments:Sender Crosstalk

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#Mixed them.
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#Incubated at 30°C.
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#Measured intensity of green fluorescence(485 nm(excitation) and 527 nm(emission)) at regular time intervals.
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Revision as of 01:19, 30 October 2008

Chiba-U.gif

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Sender Crosstalk

Design

Sender switch Chiba.jpg

Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.

異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる(1),(2).AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)

Fig.4 AHL varieties


Experiments

センダーの違いによるディレイをみることをめざし，次の表に示すセンダーとレシーバを別々の液体LB培地で培養@37°C,12h後（stationaryに達したら？対数増殖機の細胞の分裂によるsender量増加を防ぐため？），それぞれを混ぜ，30°Cで培養し，一定時間ごとのgfp蛍光強度（485nm(excitation) and 527nm(emission)）を測定した。（詳しくはページしたのdetailsへ）

senders (cell: XL10-Gold or JW1908) receiver (cell: JW1908)
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 plac+rbs+LasI] (pSB1AK3)

Tet-lasi chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] (pSB1A3)

High-Copy-Receiver Chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084008 plac+rbs+RhlI] (pSB1AK3)

Tet-rhli chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084009 BBa_K084009]

Tet-rhli chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 plac+rbs+LuxI] (pSB1AK3)

Tet-luxi-cm chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084014 BBa_K084014]

Tet-luxi chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623(ptet+rbs+LuxI(LVA))]

Chiba BBa S03623.gif

Details

Method

To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.

  1. Transformed Senders into E.coli strains(XL10Gold) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C for 12hours.
  3. Mixed them.
  4. Incubated at 30°C.
  5. Measured intensity of green fluorescence(485 nm(excitation) and 527 nm(emission)) at regular time intervals.

more details...

Results & Discussion

Fig. senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • 37°Cで行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37°C：30°C＝163：245）
  • LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
  • Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
また、差が一番でたのが30°Cで行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。

3OC6HSL,3OC12HSLに対する、LuxRの応答時間に、二時間の差ができた（3OC12HSLの場合、3OC6HSLに比べて二時間遅れて応答する）。 (そのときの条件は、培養温度30°C、genelatorの株はXL10Gold,Receiverの株はJW1908のとき、であった。) <??

Future plans

  • AHL合成酵素の発現量を減らし,AHL生産速度を遅くする.
  1. RBSをweakにする。
  2. コピーナンバーをlowにする.
  • transfer curveをシグモイダルに近づける.
  1. Positive Feedback Loopを導入する.


Other Experiments

目視実験

  • 試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200。

--Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
  • RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
  • Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • 特に37°Cで行ったときと差はない
  • BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
  • 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
  • この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）


Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@25°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。

（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30°Cや37°Cとは条件が違う。）


Demo ~Senders~

一番時差が見られたSender遺伝子のLuxIとLasIをつかってデモ実験を行った。

LuxIおよびLasIの遺伝子がそれぞれ組み込まれた大腸菌（XL10G）と、

LuxRの遺伝子が組み込まれた大腸菌（BW）を液体培養したものを 液量１：１で混ぜて、それらのGFPが発現するのを目視で観測した。


Results

Team-Chiba-demo-mihon.gif
Green region: sender=LuxI (50 uL), Red circular region: sender=Las I (50 uL).
Receiver=LuxR (50 uL)

0 h

4 h
(Lux I GFP detected)

8 h
(Lux I GFP and Las I GFP detected)

　


--toyota

-->more about Demo experiments detail

references

  1. [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract M.K Winson et al.:Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors　for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192]
  2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity BBa_F2620:Specificity]
  3. [http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/153/12/3923 Paul Williams.:Quorum sensing, communication and cross-kingdom signalling in the bacterial world.Microbiology 153 (2007), 3923-3938]
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