Team:Chiba/protocol/DNA Purification/qia/j

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QIAprep Spin Miniprep kit によるDNA精製プロトコル

  1. スピンダウンしたペレットに、Buffer:P1（冷蔵庫に保管）を200μL入れてボルテックスで懸濁
  2. Buffer:P2（アルカリ性）を250μL加え、４～６回チューブを転倒させる。溶液は青色に変化する。この時DNAが壊れてしまう可能性があるので優しく取り扱うこと。
  3. Buffer:N3（酸性）を350μL加え、すぐにチューブを４～６回転倒させて完全に混ぜる。（中和反応）沈殿が固まってしまうのを防ぐため、N3を加えたら溶液をすばやく優しくまぜる。
  4. 10分間、遠心機で13,000rpm設定で遠心。白い塊状のペレット（菌の死骸）が形成する。
  5. 4の上澄み液を直接、またはピペッティングによりQIAprepスピンカラムに入れる。
  6. 1分間遠心（13,000rpm）してカラムにDNAをつける。
  7. カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
  8. Buffer:PBを400μL入れてさらに1分間遠心（13,000rpm）。さらにDNA・プラスミドをカラムにくっつける。
  9. カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
  10. Buffer:PEを400μL入れて1分間遠心（13,000rpm）。QIAprepカラムをこの操作で洗浄する。
  11. 9～10の操作を繰り返す。
  12. 残っているBuffer:PEを除去するためにさらに1分間空遠心（13,000rpm）。PEのEtha-OHが残っていると後に続く酵素反応が阻害されてしまう。
  13. QIAprepのカラムを新しい1.5μLのマイクロ遠心チューブにセットする。この時、Etha-OHをとばすために少しだけ時間をおくとよい。
  14. Buffer:EBを100μLを各カラムの中央に敵かし１分間静置。ここでカラムからDNAの溶出を行う。
  15. 1分間遠心（13,000rpm）し、カラムをはずしてチューブの蓋を閉めたらミニプレ完了！
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