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Minnesota/14 July 2008
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| 1. Plasmid DNA Purification Using the QIAprep: Use 2mL LB cultures of ligation products from 07-11-2008. Procedure: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| a. Resuspend bacterial cells in 250uL Buffer P1 and transfer to microcentrifuge tube | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| b. Add 250 uL Buffer P2 and invert 4-6 times | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| c. Add 350uL Buffer N3 and mix immediately by inverting 4-6 times | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| d. Centrifuge for 10 minutes @ 13,000 rpm in a table-top centrifuge. White pellet will form (made up of cell debris). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| e. Apply supernatants from step D to the QIA prep spin columns. Centrifuge for 30-60 seconds --> discard the flow through. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| f. Wash the QIA prep spin column by adding 0.5mL (500uL) Buffer PB. Centrifuge for 30-60 seconds. Discard the flow through. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| g. Wash QIA prep spin column by adding 0.75mL (750uL) Buffer PE. Centrifuge for 30-60 seconds. Discard the flow through. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| h. Centrifuge for additional 1 minute to remove residual buffer. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| i. Place the QIA prep spin column in a clean 1.5mL centrifuge tube. To elute DNA, add 50uL of Buffer EB (10mM Tris-Cl, pH 8.5) to center of spin column and centrifuge. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NOTE: Used Buffers to purify or washout any cell debris so only has DNA. Used spin column b/c the column binds to DNA (has DNA affinity) and all other solution will drain through. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. Spectrophotometry: 'Spec' purified preps to check concentration of DNA in the ligated products. Refer Spectrophotometry Results link on Notebook page. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3. Double Digest: GFP + Terminator => GFP:Term. Pro/LAMBDAcI + Terminator => Pro:LAMBDAcI:Term. Pro + LAMBDAcI/Terminator => Pro:LAMBDAcI:Term.
Refer to table below.
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