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Team:Chiba/Project/Experiments:Sender Crosstalk
From 2008.igem.org
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Sender Crosstalk
Design
Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.
異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる(1),(2).AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)
Experiments
センダーの違いによるディレイをみることをめざし，次の表に示すセンダーとレシーバを別々の液体LB培地で培養@37℃,12h後（stationaryに達したら？対数増殖機の細胞の分裂によるsender量増加を防ぐため？），それぞれを混ぜ，３０℃で培養し，一定時間ごとのgfp蛍光強度（__nm）を測定した。（詳しくはページしたのdetailsへ）
| senders (cell: XL10-Gold) | receiver (cell: JW1908) |
| *[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 plac+rbs+LasI] (pSB1AK3)
| *[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] (pSB1A2)
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| *[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084008 plac+rbs+RhlI] (pSB1AK3)
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| *[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 plac+rbs+LuxI] (pSB1AK3)
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Results&Discussion
Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- 37°Cで行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
- LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
- Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
- また、差が一番でたのが30°Cで行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。
3OC6HSL,3OC12HSLに対する、LuxRの応答時間に、二時間の差ができた（3OC12HSLの場合、3OC6HSLに比べて二時間遅れて応答する）。 (そのときの条件は、培養温度30°C、genelatorの株はXL10Gold,Receiverの株はJW1908のとき、であった。) <??
Future plans
Details
Method
1.Crosstalk test
To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.
- Transformed Senders into E.coli strains(XL10GOLD) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
- Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h
- Mixed them.
- Incubated at 30°C.
- Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.
Other Experiments
目視実験
- 試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200。
--Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)
Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
- RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
- Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。
Senders(JW1908),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- 特に37°Cで行ったときと差はない
- BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
- 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。
Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
- この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
- （８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）
Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@25°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。
（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。）
