Team:Chiba/Project/Experiments:Sender Crosstalk

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Chiba-U.gif

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Sender Crosstalk

Design

Sender switch Chiba.jpg

Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.

異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる(1),(2).AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)

Fig.4 AHL varieties


Experiments

センダーの違いによるディレイをみることをめざし，次の表に示すセンダーとレシーバを別々の液体LB培地で培養@37°C,12h後（stationaryに達したら？対数増殖機の細胞の分裂によるsender量増加を防ぐため？），それぞれを混ぜ，30°Cで培養し，一定時間ごとのgfp蛍光強度（485nm(excitation) and 527nm(emission)）を測定した。（詳しくはページしたのdetailsへ）

senders (cell: XL10-Gold or JW1908) receiver (cell: JW1908)
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 plac+rbs+LasI] (pSB1AK3)

Tet-lasi chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] (pSB1A3)

High-Copy-Receiver Chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084008 plac+rbs+RhlI] (pSB1AK3)

Tet-rhli chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084009 BBa_K084009]

Tet-rhli chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 plac+rbs+LuxI] (pSB1AK3)

Tet-luxi-cm chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084014 BBa_K084014]

Tet-luxi chiba.gif

*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623(ptet+rbs+LuxI(LVA))]

Chiba BBa S03623.gif

Results & Discussion

Fig. senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • 37°Cで行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37°C：30°C＝163：245）
  • LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
  • Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
また、差が一番でたのが30°Cで行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。

3OC6HSL,3OC12HSLに対する、LuxRの応答時間に、二時間の差ができた（3OC12HSLの場合、3OC6HSLに比べて二時間遅れて応答する）。 (そのときの条件は、培養温度30°C、genelatorの株はXL10Gold,Receiverの株はJW1908のとき、であった。) <??

Future plans

  • AHL合成酵素の発現量を減らし,AHL生産速度を遅くする.
  1. RBSをweakにする。
  2. コピーナンバーをlowにする.
  • transfer curveをシグモイダルに近づける.
  1. Positive Feedback Loopを導入する.


Other Experiments

目視実験

  • 試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200。

--Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
  • RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
  • Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • 特に37°Cで行ったときと差はない
  • BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
  • 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
  • この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）


Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@25°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。

（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30°Cや37°Cとは条件が違う。）


Demo ~Senders~

一番時差が見られたSender遺伝子のLuxIとLasIをつかってデモ実験を行った。

LuxIおよびLasIの遺伝子がそれぞれ組み込まれた大腸菌（XL10G）と、

LuxRの遺伝子が組み込まれた大腸菌（BW）を液体培養したものを 液量１：１で混ぜて、それらのGFPが発現するのを目視で観測した。


Results

Team-Chiba-demo-mihon.gif
Green region: sender=LuxI (100 uL), Red circular region: sender=Las I (100uL).
Receiver=LuxR (???? uL)

0 h

4 h
(Lux I GFP detected)

8 h
(Lux I GFP and Las I GFP detected)

　


--toyota

-->more about Demo experiments detail

references

  1. [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract M.K Winson et al.:Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors　for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192]
  2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity BBa_F2620:Specificity]
  3. [http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/153/12/3923 Paul Williams.:Quorum sensing, communication and cross-kingdom signalling in the bacterial world.Microbiology 153 (2007), 3923-3938]
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