Team:Chiba/Project/Experiments:Crosstalk

From 2008.igem.org

Sender Crosstalk

Design

Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.

異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる(1),(2).AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)

Fig.4 AHL varieties

Experiments

センダーの違いによるディレイをみることをめざし，次の表に示すセンダーとレシーバを別々の培地で培養@37℃,12h後（stationaryに達したら？対数増殖機の細胞の分裂によるsender量増加を防ぐため？），それぞれを混ぜ，３０℃で培養し，一定時間ごとの蛍光強度（__nm）を測定した。

senders (cell: XL10-Gold)	receiver (cell: JW1908)
*plac+rbs+LasI (plasmid?)	*BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL) (plasmid?)
*plac+rbs+RhlI (plasmid?)
*plac+rbs+LuxI (plasmid?)

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

37°Cで行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。

また、差が一番でたのが30°Cで行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。

Results&Discussion

Fig. senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.

3OC6HSL,3OC12HSLに対する、LuxRの応答時間に、二時間の差ができた（3OC12HSLの場合、3OC6HSLに比べて二時間遅れて応答する）。 (そのときの条件は、培養温度30°C、genelatorの株はXL10Gold,Receiverの株はJW1908のとき、であった。) <??

Future plans

Details

Method

1.Crosstalk test

To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.

Transformed Senders into E.coli strains(XL10GOLD) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h
Mixed them.
Incubated at 30°C.
Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.

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Other Experiments

目視実験

試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200。

--Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

特に37°Cで行ったときと差はない
BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。

（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@25°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。

（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。）