PCR1

• pFlhDC (O111-F / O113-R)
• Gene FlhDC (O134-F / O131-R)
• pFlgB (O102-F / O103-R)
• pFlhB (O108-F / O109-R)

Program: Gradient
Denaturation :
98°C-5'
Cycling 1 (3X) :
98°C-10"
Gradient 61°C +/-10°C - 30
72°C-30"
Cycling 2 (25X) :
98°C-10"
72°C-30"
Elongation :
72°C-5'

Vf=20µL
H20=13,4µL
Buffer5X=4µL
dNTP=0,4µL
O1=1µL
O2=1µL
Phusion=0,2µL

PCR2

• pFliA (rbs) (O145-F / O144-R)
• pFliA (O145-F / O146-R)
• pFliA +Gene FliA (O145-F / O151-R)

Program: promoter
Denaturation :
98°C-5'
Cycling 1 (3X) :
98°C-10"
55°C - 30
72°C-30"
Cycling 2 (30X) :
98°C-10"
65°C-30" 72°C-30"
Elongation :
72°C-5'

Vf=50µL
H20=33,5µL
Buffer5X=10µL
dNTP=1µL
O1=2,5µL
O2=2,5µL
Phusion=0,5µL

PCR3

• PCRFliA1 (O143-F / O152-R)
• PCRFliA2 (O153-F / O150-R)
• PCRFliA3 (O148-F / O150-R)

Program: PCRFliA1
Denaturation :
98°C-5'
Cycling 1 (30X) :
98°C-10"
Gradient 66°C +/-6°C - 25
72°C-20"
Elongation :
72°C-5'

Program: PCRFliA2
Denaturation :
98°C-5'
Cycling 1 (3X) :
98°C-10"
Gradient 61°C +/-10°C - 25
72°C-20"
Cycling 2 (30X) :
98°C-10"
72°C-30"
Elongation :
72°C-5'

Program: PCRFliA3
Denaturation :
98°C-30'
Cycling 1 (2X) :
98°C-10"
72°C-30"
Cycling 2 (5X) :
98°C-10"
98°C->72°C low decreasing 1.0°C/s
72°C-30"
Elongation :
72°C-5'

Cloning of EnvZ*

Concentration measurement by Biophotometer

Ligation