Team:Chiba/jk/β

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Revision as of 16:58, 24 September 2008

送受信班の実験ノート

モジュール解説

感度差による応答時間の差

任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。

Controlling the Delay time of the AHL signaling

LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。

LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合
LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
クロストークを使う場合

AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。

AHLsおよびその合成酵素
- P.aeruginosa->C4-AHL(RhlI)
- V. fisheri->C6-3-oxo-AHL(LuxI)
- A.tumefaciens->C8-3-oxo-AHL(TraI)
- P.aeruginosa->C10-3-oxo-AHL(VanI)
- P.aeruginosa->C12-3-oxo-AHL(LasI)
- R.leguminosarum->C14-3-hydroxy-AHL(CinI)

Construction(From BioBrick)

Sender(Autoinducer synthase)

LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)

Receiver

LuxR,LasR,CinR,RhlR

実験

Cross-Talk Check

LuxR vs LuxI(OK),LasI(OK),CinI(?),RhlI(OK)
LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR

RBS交換

既存のパーツ
- B0034+luxI
New parts(planning)
- B0033(weak)+luxI
- B0032(medium)+luxI
- B0031(weaker)+luxI

time-delay実験結果

Discussion
- トランスファーカーブの形はすべて同じ。蛍光強度のみが低下する（cross-talk,Sendersを減らした場合）
- 原理（仮説）に問題あり？

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 #LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合<br>LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.''et al.:''Mol.Microbiol.2005.'''55'''(3).712–723]
 #クロストークを使う場合
-Crosstalkが起こりうることをまず説明。そしてそのcrosstalkの程度を知らせる。そしてsignal分子の蓄積速度が一定ならば，1/20のcrosstalk効率のLuxI-LuxR/Pluxよりも20倍
+:AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
+*AHLsおよびその合成酵素
-#インデューサーの合成速度を下げる。<Br>RBSの調整(B0030-->B0033)<Br>コピー数の調整(5-->300)
-#レセプタータンパク質とAHLとの親和性を下げる-->複合体を形成しにくくする。<Br>クオラムセンシングのクロストークを利用する。生物によってAHL(Acyl-L-Homoserine Lactone)のアシル基が異なる([[Team:Chiba/Reference/j|ref.3]]).<Br>生物種ごとのクオラムセンシングについては、[[Team:Chiba/Reference/j|ref.9]]参照.
-*ex)(  )内はシンターゼ
 **P.aeruginosa->C4-AHL(RhlI)
 **V. fisheri->C6-3-oxo-AHL(LuxI)
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 **R.leguminosarum->C14-3-hydroxy-AHL(CinI)
-'''Construction'''(From BioBrick)
+===Construction(From BioBrick)===
 :*Sender(Autoinducer synthase)
 ::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
 :*Receiver
 ::LuxR,LasR,CinR,RhlR
+==実験==
-'''Cross-Talk Check'''
+===Cross-Talk Check===
 #LuxR vs LuxI('''OK'''),LasI('''OK'''),CinI(?),RhlI('''OK''')
 #LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR