Team:Chiba/jk/β

From 2008.igem.org

送受信班の実験ノート

モジュール解説

感度差による応答時間の差

任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。

Controlling the Delay time of the AHL signaling

LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。

LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合
LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
クロストークを使う場合

AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。

AHLsおよびその合成酵素

Strain	Signal Molecule	Enzyme
P.aeruginosa	C4-HSL	RhlI
V. fisheri	C6-3-oxo-HSL	LuxI
A.tumefaciens	C8-3-oxo-HSL	TraI
P.aeruginosa	C10-3-oxo-HSL	VanI
P.aeruginosa	C12-3-oxo-HSL	LasI
R.leguminosarum	C14-3-hydroxy-HSL	CinI

[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity AHLsについて]

実験

Construction(From BioBrick)

Sender(Autoinducer synthase)

LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)

Receiver

LuxR,LasR,CinR,RhlR

Cross-Talk Check

LuxR vs LuxI(OK),LasI(OK),CinI(No),RhlI(OK)
LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR-->発現を確認できず

time-delay test

time-delay protocol

連絡

pptに載せたいもの

作ったもの

絵で、わかりやすく。～Isごとに色を変える。

time-delay実験結果の整理(25/9)

実験操作を分かりやすく書く
比較するもの
- LuxI,LasI,RhlI
- TAG有/無
- 温度
- 菌数比
- 株
ポイント

正しく書きだす
推論を立てる（帰納的に、結論を急がないこと）

固体培地spot実験(28/9)

前日

IPTG入りLB-Agar-amp（20ml）に、T9002を2ml(10³-10⁵ cells/2ml)撒く-->37℃,O/N
～Is（5種類）をLB-Amp,2ml培養

当日

T9002がコロニーを形成したプレートの中心に、~Isの培養液を1μl,spotする。
gfpの発現が同心円状に広がっていく。その計時変化を記録する。