Team:Chiba/notebook/input/august

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)
(2008.8.25)
m (2008.8.30)
 
(19 intermediate revisions not shown)
Line 5: Line 5:
== 2008.8.20==
== 2008.8.20==
-
PCR:'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
-
<BR>・BBa_J22136(2007)①
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)①
-
<BR>・BBa_J22136(2008)②
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2008)②
-
<BR>・BBa_J22141(2007)③
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)③
-
<BR>・BBa_J22141(2008)④
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2008)④
-
<BR>・BBa_E0612(2008)⑤
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_E0612 BBa_E0612](2008)⑤
<table width="250" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="250" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<tr>
<tr>
-
<td width="257">Sample No</td>
+
<td width="257">Sample No.</td>
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td>
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td>
</tr>
</tr>
Line 41: Line 41:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>dH2O</td>
+
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td>
<td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td><td>68</td>
</tr>
</tr>
Line 49: Line 49:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<BR>→gel check:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+
 
 +
-->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
                
                
   
   
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<tr>
<tr>
-
<td width="257">Sample No</td>
+
<td width="257">Sample No.</td>
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td>
<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td>
</tr>
</tr>
Line 75: Line 76:
</table>
</table>
-
→どれもバンド出ず。
 
 +
-->どれもバンド出ず。
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
-
<BR>trnsformation:'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
+
-->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)
-
 
+
-
<BR>・BBa_R0051(2007)
+
-
<BR>・BBa_R0051(2006)
+
-
<BR>・BBa_J06650(2007)
+
-
<BR>・BBa_J06650(2006)
+
-
<BR>・BBa_J22136(2007)
+
-
<BR>・BBa_J22141(2007)
+
-
 
+
-
→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)
+
== 2008.8.21 ==
== 2008.8.21 ==
8.20にtransformationしたもの
8.20にtransformationしたもの
-
<BR>・BBa_R0051(2007)
+
 
-
<BR>・BBa_R0051(2006)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
-
<BR>・BBa_J06650(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
-
<BR>・BBa_J06650(2006)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
-
<BR>・BBa_J22136(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
-
<BR>・BBa_J22141(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
 +
 
を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、
を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、
さらに1h培養した。
さらに1h培養した。
-
<BR>UV照射実験(プレート編)
+
<br>UV照射実験(プレート編)(~24日)
-
<BR>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-(BWΔtdk)の2plasmidのものを使用。
+
<br>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
-
<BR>グリストをつついて、AHL(100nM)
+
<br>グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
 +
<br>37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを10<sup>5</sup>希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
 +
<br>37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
 +
<br>UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
 +
<br>両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
 +
<br>37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに10<sup>5</sup>希釈して20μl撒いた。
 +
 
 +
 
 +
コロニー数
 +
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="257"></td>
 +
<td>AHLなし</td><td>AHL100nM</td>
 +
<tr>
 +
<td>9h</td>
 +
<td>606</td><td>453</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>12h</td>
 +
<td>146</td><td>151</td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
 
 +
 
 +
AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK
== 2008.8.22 ==
== 2008.8.22 ==
-
mini prep:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
<BR>2ml培養した
<BR>2ml培養した
-
<BR>・BBa_R0051(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
-
<BR>・BBa_R0051(2006)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
-
<BR>・BBa_J06650(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
-
<BR>・BBa_J06650(2006)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
-
<BR>・BBa_J22136(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
-
<BR>・BBa_J22141(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
-
<BR>をミニプレした。
+
-
<BR>insert check:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
をミニプレした。
-
<BR>BBa_J06650(2006)
+
insert check:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-
<BR>BBa_J06650(2007)
+
 
-
<BR>BBa_J22136(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
-
<BR>BBa_J22141(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
-
<BR>BBa_R0051(2006)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
-
<BR>BBa_R0051(2007)
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
-
<BR>BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
+
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
 +
*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
 +
 
 +
[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)と[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
<BR>
<BR>
<BR>混ぜ表
<BR>混ぜ表
Line 154: Line 180:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
 +
 +
<BR>UV照射実験(液体編)(~24)
 +
<BR>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
 +
<BR>グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
 +
<BR>37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
 +
<BR>UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ10<sup>5</sup>希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。
 +
 +
<BR>37℃で12h培養した後のコロニー数
 +
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="257"></td>
 +
<td>AHLなし</td><td>AHL100nM</td>
 +
<tr>
 +
<td>15min</td>
 +
<td>136</td><td>0?</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>4h</td>
 +
<td>40</td><td>31</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>8h</td>
 +
<td>10</td><td>0</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>12h</td>
 +
<td>0</td><td>0</td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
<BR>
 +
いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。
== 2008.8.25 ==
== 2008.8.25 ==
-
BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり
+
[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](insert check済み)のグリセロールストックづくり
<BR><BR>プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
<BR><BR>プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
<BR>培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
<BR>培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
Line 172: Line 228:
</table>
</table>
 +
== 2008.8.28 ==
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
-
<BR>UV照射実験
+
[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106](2007)
-
<BR>-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
+
生えてきたコロニーを10ml培養して'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''(60mlで溶出):
-
<BR>グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
+
-
<BR>37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを10<sup>5</sup>希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
+
-
<BR>37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
+
-
<BR>UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
+
-
<BR>両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
+
-
<BR>37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに10<sup>5</sup>希釈して20μl撒いた。
+
-
== 2008.8.28 ==
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-
transformation:'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
+
<br>混ぜ表
-
<BR>BBa_I7106(2007)
+
-
生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
+
-
 
+
-
<BR>→Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
-
<BR>混ぜ表
+
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
Line 221: Line 268:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
Digestion 37℃、30分
+
'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]''' 37℃、30分
<BR>プラスミドの濃度は33.6ng/μl
<BR>プラスミドの濃度は33.6ng/μl
-
<BR>PCR:'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
<BR>RBS+CI
<BR>RBS+CI
<BR>混ぜ表
<BR>混ぜ表
Line 258: Line 305:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>dH2O</td>
+
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>34</td>
<td>34</td>
</tr>
</tr>
Line 267: Line 314:
</table>
</table>
-
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+
 
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|ゲルチェック]]'''
Line 288: Line 336:
</table>
</table>
-
→濃度は33.6ng/μg
+
-->濃度は33.6ng/μg
-
<BR>ベクターのPCR:'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+
 
-
<BR>BBa_I7106
+
ベクターの'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
<br>[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106]
 +
<br>混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<tr>
<tr>
Line 322: Line 371:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>dH2O</td>
+
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>68</td>
<td>68</td>
</tr>
</tr>
Line 331: Line 380:
</table>
</table>
-
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+
 
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|ゲルチェック]]'''
    
    
                
                
Line 343: Line 393:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>dH<SUB>2</SUB>O</td>
+
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>4</td>
<td>4</td>
</tr>
</tr>
Line 351: Line 401:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→バンド出ず。
+
-->バンド出ず。
== 2008.8.30 ==
== 2008.8.30 ==
-
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-
<BR>x-RBS-cI-s-p(780bp)
+
 
-
<BR>混ぜ表
+
x-RBS-cI-s-p(780bp)
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
Line 389: Line 441:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→30μlゲル抽出
+
-->30μlゲル抽出
-
<BR>→ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+
-
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+
-
<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]'''
-
<BR>
+
 
-
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-
<BR>-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
+
 
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用
 +
 
 +
 
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
 +
 
 +
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
Line 430: Line 488:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→30μlゲル抽出
+
-->30μlゲル抽出
-
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+
-
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+
-
<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|ゲル抽出]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
 +
 
 +
-->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
 +
 
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 461: Line 522:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック
-
<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
+
-->OK,4μlはLigation用
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
 
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
-
<td></td><td>b.g</td>
+
<td>-</td><td>b.g</td>
<tr>
<tr>
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
Line 493: Line 558:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
 
-
<BR>→CFU40(b.gは22)
 
-
<BR>コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G)
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
-->CFU40(b.gは22)
 +
 
 +
 
 +
コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]'''
 +
 
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<tr>
<tr>
Line 523: Line 593:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>dH2O</td>
+
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>11.7</td>
<td>11.7</td>
</tr>
</tr>
Line 531: Line 601:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
+
-->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
-
<BR>→mini prep:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
+
 +
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]'''
-
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
 
-
<BR>x-RBS-cI-s-p(780bp)
+
'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
x-RBS-cI-s-p(780bp)
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
Line 573: Line 646:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+
 
-
<BR>混ぜ表
+
'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 591: Line 666:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
 
-
<BR>→NFW5μlで溶出
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+
-
<BR>混ぜ表
+
-->NFW5μlで溶出
 +
 
 +
-->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
 +
 
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 617: Line 695:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→ゲルチェックOK
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''-->OK
-
<BR>
+
 
-
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
+
 
-
<BR>-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
+
 
-
<BR>混ぜ表
+
'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
 +
 
 +
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
Line 655: Line 737:
</table>
</table>
-
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/gelex|Gel Extract]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 673: Line 756:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
 
-
<BR>→NFW10μlで溶出
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-
<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
+
-->NFW10μlで溶出
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
-->'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/dephosphorylation|SAP]]'''
 +
 
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 704: Line 790:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
+
-->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
-
<BR>→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
+
-
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
+
-
→NFW5μlで抽出
+
-->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
-
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/zymocleam|Zymo Clean]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
-->NFW5μlで抽出
 +
 
 +
'''[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]'''
 +
 
 +
 
 +
混ぜ表
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="57"></td>
<td width="57"></td>
Line 732: Line 821:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→ゲルチェックOK
+
-->ゲルチェックOK
-
<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
+
'''[[Team:Chiba/protocol/ligation/ligation|Ligation]]'''
-
<BR>混ぜ表
+
 
 +
混ぜ表
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
<td width="257"></td>
<td width="257"></td>
-
<td></td><td>b.g</td>
+
<td>-</td><td>b.g</td>
<tr>
<tr>
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
Line 764: Line 854:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→25℃で2h放置
+
-->25℃で2h放置
-
→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
+
-->'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''(XL10G):
-
<BR>→CFU40(b.gは22)
+
 
-
<BR><BR>
+
-->CFU40(b.gは22)

Latest revision as of 05:02, 24 October 2008

8月の実験ログ

9月の実験ログはこちらから。
入力班のページに戻る

Contents

2008.8.20

PCR

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)①
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2008)②
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)③
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2008)④
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_E0612 BBa_E0612](2008)⑤
>
Sample No.
DNA tamplate 11111
FW primer 55555
VR primer 55555
dNTPmix 1010101010
thermo pol buffer 1010101010
DNA pol(VENT) 11111
dH2O 6868686868
TOTAL 100100100100100

-->Gel Check


>
Sample No.
Sample DNA 11111
loading dye 11111
dH2O 44444
Total 66666

-->どれもバンド出ず。

Transformation

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

-->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(1個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

を2ml培養、12h。ただしコロニーが1個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。



UV照射実験(プレート編)(~24日)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた。


コロニー数

AHLなしAHL100nM
9h 606453
12h 146151


AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK

2008.8.22

Mini prep


2ml培養した

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)

をミニプレした。

insert check:Digestion

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J06650 BBa_J06650](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_J22141 BBa_J22141](2007)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)

[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2007)と[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0051 BBa_R0051](2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

doublesimgle
dH2O 1425
10×BSA 710
10×NE 710
EcoRI 3.55
PstI 3.5-


UV照射実験(液体編)(~24)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ105希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。


37℃で12h培養した後のコロニー数

AHLなしAHL100nM
15min 1360?
4h 4031
8h 100
12h 00


いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。

2008.8.25

[http://partsregistry.org/Part:BBa_J22136 BBa_J22136](insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。


OD=0.495培養液 0.67μl
60%グリセロール 0.33μl
20%グリセロールストック(計) 1.00ml

2008.8.28

Transformation

[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106](2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してMini prep(60mlで溶出):

-->Digestion
混ぜ表

double
dH2O 2
10×BSA 1
10×NE 1
EcoRI 0.5
PstI 0.5
DNA 5
TOTAL 10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl


PCR
RBS+CI
混ぜ表

DNA 1
FW primer 2.5
VR primer 2.5
dNTPmix 5
thermo pol buffer 5
DNA pol(VENT) 1
dH2O 34
TOTAL 50


ゲルチェック


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

-->濃度は33.6ng/μg


ベクターのPCR
[http://partsregistry.org/Part:BBa_I7106 BBa_I7106]
混ぜ表

DNA 1
FW primer 5
VR primer 5
dNTPmix 10
thermo pol buffer 10
DNA pol(VENT) 1
dH2O 68
TOTAL 100


ゲルチェック


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

-->バンド出ず。

2008.8.30

Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

-->30μlゲル抽出

-->ゲル抽出

-->Zymo Clean


5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用


Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL 60

-->30μlゲル抽出

ゲル抽出

-->Zymo Clean

-->SAP


混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer 10
TOTAL 30

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック

-->OK,4μlはLigation用


Ligation

混ぜ表

-b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

-->Transformation(XL10G)

-->CFU40(b.gは22)


コロニーPCR(16コつつく):PCR


混ぜ表

VF 2
VFR 2
dNTP 2
thermo pol buffer 2
Tag 0.3
dH2O 11.7
TOTAL 20

-->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。

-->Mini prep



Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

Gel Extract

混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36

-->Zymo Clean

-->NFW5μlで溶出

-->Gel Check


混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

-->Gel Check-->OK


Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL 60

Gel Extract

混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36

-->Zymo Clean

-->NFW10μlで溶出


-->SAP


混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer(×10) 10
TOTAL 30

-->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,

-->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX -->Zymo Clean

-->NFW5μlで抽出

Gel Check


混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

-->ゲルチェックOK

Ligation

混ぜ表

-b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

-->25℃で2h放置 -->Transformation(XL10G):

-->CFU40(b.gは22)