Team:Chiba/jk/β

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(→実験について（どこにおいたらいいか分からなかったので～不必要かも）)
 
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>[[Team:Chiba/jk|実験ログ]]<Br>
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<html><link rel="stylesheet" href="https://2008.igem.org/wiki/index.php?title=User:Maiko/chiba.css&action=raw&ctype=text/css" type="text/css" /></html>
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>[[Team:Chiba/Internal|ノートに戻る]]
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==送受信班の実験ノート==
==送受信班の実験ノート==
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*[[Team:Chiba/jk/β/weak 1|week 1]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 1|week 1]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/weak 2|week 2]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 2|week 2]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/weak 3|week 3]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 3|week 3]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/weak 4|week 4]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 4|week 4]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/weak 5|week 5]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 5|week 5]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 6|week 6]]
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==モジュール解説==
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===感度差による応答時間の差===
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任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。
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=='''実験について（どこにおいたらいいか分からなかったので～不必要かも）'''==
+
=== Controlling the Delay time of the AHL signaling ===
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===時間スイッチ作成===
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LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。
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#LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合<br>LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.''et al.:''Mol.Microbiol.2005.'''55'''(3).712–723]
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#クロストークを使う場合
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:AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
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発現時間の調節をするために、以下の要件が挙げられる。
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*AHLsおよびその合成酵素
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<table width="500" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000" center>
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<tr>
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<td width="200">Strain</td>
 +
<td width="200">Signal Molecule</td>
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<td width="150">Enzyme<td>
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</tr>
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<tr>
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<td>P.aeruginosa</td>
 +
<td>C4-HSL</td>
 +
<td>RhlI</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>V. fisheri</td>
 +
<td>C6-3-oxo-HSL</td>
 +
<td>LuxI</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>A.tumefaciens</td>
 +
<td>C8-3-oxo-HSL</td>
 +
<td>TraI</td>
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</tr>
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<tr>
 +
<td>P.aeruginosa</td>
 +
<td>C10-3-oxo-HSL</td>
 +
<td>VanI</td>
 +
</tr>
-
#インデューサーの合成速度を下げる。<Br>RBSの調整(B0030-->B0033)<Br>コピー数の調整(5-->300)
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<tr>
-
#レセプタータンパク質とAHLとの親和性を下げる-->複合体を形成しにくくする。<Br>クオラムセンシングのクロストークを利用する。生物によってAHL(Acyl-L-Homoserine Lactone)のアシル基が異なる([[Team:Chiba/Reference/j|ref.3]]).<Br>生物種ごとのクオラムセンシングについては、[[Team:Chiba/Reference/j|ref.9]]参照.
+
<td>P.aeruginosa</td>
 +
<td>C12-3-oxo-HSL</td>
 +
<td>LasI</td>
 +
</tr>
-
*ex)(  )内はシンターゼ
+
<tr>
-
**P.aeruginosa->C4-AHL(RhlI)
+
<td>R.leguminosarum</td>
-
**V. fisheri->C6-3-oxo-AHL(LuxI)
+
<td>C14-3-hydroxy-HSL</td>
-
**A.tumefaciens->C8-3-oxo-AHL(TraI)
+
<td>CinI</td>
-
**P.aeruginosa->C10-3-oxo-AHL(VanI)
+
</tr>
-
**P.aeruginosa->C12-3-oxo-AHL(LasI)
+
</table>
-
**R.leguminosarum->C14-3-hydroxy-AHL(CinI)
+
[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity AHLsについて]
-
'''Construction'''(From BioBrick)
+
==実験==
 +
===Construction(From BioBrick)===
:*Sender(Autoinducer synthase)
:*Sender(Autoinducer synthase)
::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
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::LuxR,LasR,CinR,RhlR
::LuxR,LasR,CinR,RhlR
-
'''Cross-Talk Check'''
 
-
#LuxR vs LuxI('''OK'''),LasI('''OK'''),CinI(?),RhlI('''OK''')
 
-
#LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR
 
-
'''RBS交換'''<Br>
+
===Cross-Talk Check===
-
*既存のパーツ
+
#LuxR vs LuxI('''OK'''),LasI('''OK'''),CinI('''No'''),RhlI('''OK''')
-
**B0034+luxI<Br>
+
#LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR-->発現を確認できず
-
*New parts(planning)
+
-
**B0033(weak)+luxI
+
-
**B0032(medium)+luxI
+
-
**B0031(weaker)+luxI
+
-
===time-delay実験結果===
+
===time-delay test===
-
#株：Sender-->BW⊿FliC,Receiver-->BW⊿FliC<Br>'''mix''':Senders:Receiver = 1:1,1:10,1:100,1:1000<Br>Temparature=37℃,30℃
+
[[Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j|time-delay protocol]]
-
#株Senders-->XL10Gold,Receiver-->BW⊿FliC<Br>'''mix''':Senders:Receiver = 1:1,1:10,1:100,1:1000<Br>Temparature=37℃,30℃,RT
+
-
*Discussion
+
-
**トランスファーカーブの形はすべて同じ。蛍光強度のみが低下する（cross-talk,Sendersを減らした場合）
+
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**原理（仮説）に問題あり？
+
-
**
+
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==連絡==
 +
===pptに載せたいもの===
 +
====作ったもの====
 +
*絵で、わかりやすく。～Isごとに色を変える。
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====time-delay実験結果の整理(25/9)====
 +
*実験操作を分かりやすく書く
 +
*比較するもの
 +
**LuxI,LasI,RhlI
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**TAG有/無
 +
**温度
 +
**菌数比
 +
**株
 +
*ポイント
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#正しく書きだす
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#推論を立てる（帰納的に、結論を急がないこと）
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====固体培地spot実験(28/9)====
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前日
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*IPTG入りLB-Agar-amp（20ml）に、T9002を2ml(10<sup>3</sup>-10<sup>5</sup> cells/2ml)撒く-->37℃,O/N
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*～Is（5種類）をLB-Amp,2ml培養
 +
当日
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*T9002がコロニーを形成したプレートの中心に、~Isの培養液を1μl,spotする。
 +
*gfpの発現が同心円状に広がっていく。その計時変化を記録する。
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+
{| style="color:white;" cellpadding="3" cellspacing="3" border="0" width="100%" align="center" class="menu" |
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{| style="color:white;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"
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!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
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!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|Parts Submitted to the Registry]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|作成したDNAパーツ]]
-
!align="center"|[[Team:Chiba/Modeling/j|モデリング]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
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Latest revision as of 11:27, 14 December 2008

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Contents

送受信班の実験ノート

モジュール解説

感度差による応答時間の差

任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。

Controlling the Delay time of the AHL signaling

LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。

  1. LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合
    LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
  2. クロストークを使う場合
AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
  • AHLsおよびその合成酵素
Strain Signal Molecule Enzyme
P.aeruginosa C4-HSL RhlI
V. fisheri C6-3-oxo-HSL LuxI
A.tumefaciens C8-3-oxo-HSL TraI
P.aeruginosa C10-3-oxo-HSL VanI
P.aeruginosa C12-3-oxo-HSL LasI
R.leguminosarum C14-3-hydroxy-HSL CinI

[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity AHLsについて]

実験

Construction(From BioBrick)

  • Sender(Autoinducer synthase)
LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
  • Receiver
LuxR,LasR,CinR,RhlR


Cross-Talk Check

  1. LuxR vs LuxI(OK),LasI(OK),CinI(No),RhlI(OK)
  2. LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR-->発現を確認できず

time-delay test

time-delay protocol

連絡

pptに載せたいもの

作ったもの

  • 絵で、わかりやすく。～Isごとに色を変える。

time-delay実験結果の整理(25/9)

  • 実験操作を分かりやすく書く
  • 比較するもの
    • LuxI,LasI,RhlI
    • TAG有/無
    • 温度
    • 菌数比
    • 株
  • ポイント
  1. 正しく書きだす
  2. 推論を立てる（帰納的に、結論を急がないこと）

固体培地spot実験(28/9)

前日

  • IPTG入りLB-Agar-amp（20ml）に、T9002を2ml(103-105 cells/2ml)撒く-->37℃,O/N
  • ～Is（5種類）をLB-Amp,2ml培養

当日

  • T9002がコロニーを形成したプレートの中心に、~Isの培養液を1μl,spotする。
  • gfpの発現が同心円状に広がっていく。その計時変化を記録する。


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